研究策略 | 环形RNA的翻译
实验中可以使用放线菌酮(Cycloheximide)或三尖杉酯碱(Harringtonine)抑制翻译进行,之后裂解细胞,然后以蔗糖密度梯度离心分离不同组分(polysome profiling),接着从polysomes组分中分离RNA。或者以30%的蔗糖溶液进行离心分离RNC沉淀(full-length translating mRNA profiling),接着从RNA沉淀中分离RNA。再对分离的RNA进行高通量测序分析,测序之前进行RNase R消化以富集环形RNA是一个可选项。另外可以分离核糖体后先使用低浓度的RNase T1进行消化(ribosome profiling),然后分离核糖体单体亚基之间被保护的RNA片段(ribosome footprints, RFPs)。再对这些RNA片段进行高通量测序,从测序reads中搜索符合环形RNA的backspliced junction。
另外有文章报道甲基化修饰m6A可以促进环形RNA翻译,因此可以提取total RNA后使用m6A抗体做IP,富集含m6A的RNA,之后进行高通量测序分析。
分析后需要实验证据证明待定的环形RNA可以翻译,因此需要构建环形RNA的过表达载体,以及添加标签(如3xFlag)、删除ATG、删除下游IR和对应ORF线性翻译的阳性对照载体等。翻译验证可以先使用RRL等体外翻译系统,再转染细胞或使用AAV注射小鼠后进行检测,初步证明预测的环形RNA及ORF可以翻译。
接下来分析验证环形RNA和核糖体的结合,可以使用蔗糖密度梯度离心分离不同的核糖体组分,然后以RT-PCR检测组分中的环形RNA。
最后还要分析序列翻译的起始机制,最常见的是考虑IRES介导,可以使用现有的工具(如circBank、circRNADb数据库)预测序列中的IRES活性片段,再构建报告载体验证IRES活性。也有考虑m6A介导的翻译,可以预测m6A位点,并构建野生型和位点突变型载体进行验证。
之后可以使用定制的特异性抗体进行IP,富集目的条带后进行质谱检测(液相-二级质谱串联,LC-MS/MS),以验证确认相应的肽段(氨基酸序列)。
另外可以补充验证环形RNA或环形RNA翻译的蛋白质与翻译起始因子的互作,如与IRES介导对应的eIF4G或ITAF,以及与m6A介导对应的YTHDF1/2/3等。
来源:circRNA
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