12.00 双特异抗体突变位点引物求大神指导

项目进度

  • 发布需求

    2017-09-08

  • 威客交稿

    2017-09-28

  • 雇主选稿

    2017-10-03

  • 公示期

    2017-10-03

  • 5

    评价

需求描述

要在IGG1抗体重链上突变一个F405L ,但是这部分区域用PRIMER5找不到非特异性结合很少且3’端非特异性结合△G很小的,最合适的也有-11.多,尝试了一组引物  得不到目标突变产物。   想用OVERLAP PCR来做突变,一条引物3端△G也有-12.8,两条引物都长32,突变位点在中间, 且引物二聚体自由能有-65, 用10ng的质粒来做,  体系是17.5微升水,2.5微升DNTP,2.5微升KOD PLUS BUFFER, 各0.75微升的上下游引物,0.5微的KOD PLUS,程序是95° 30s, 95°30s, 55℃ 1min, 68°13 min, 15个循环,再延伸10min,  PCR完后取4微升跑胶,没有看到目标条带,(或是太淡没发现。。),DPN1消化以后在做转化中,但是师姐说没有条带一般就不会转化出来目标产物了。  质粒全长11bp,  求各位前辈指点下目前我应该怎么做,是加镁离子做温度梯度摸条件还是加大循环数呢,我觉得引物二聚体的△G太高了,这会有影响吗。

精准对接
一等奖

投稿人: 李博

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二等奖

投稿人: cit

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二等奖

投稿人: wersdu

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显示 1~3 项 共 3 个投稿

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