10.00 质粒转染问题

项目进度

  • 发布需求

    2017-09-11

  • 威客交稿

    2017-10-01

  • 雇主选稿

    2017-10-06

  • 公示期

    2017-10-06

  • 5

    评价

需求描述

质粒带有GFP标签,总共三个,0组个为带GFP标签的空载体,1组、、2组为带GFP标签的目的基因质粒,转染HEK293

总共转染四次。第一次用lipo2000,按照说明书转的,荧光显微镜下观察,三组均木有荧光。

第二次用LIPO3000,荧光显微镜下观察0组有荧光,1、2组无荧光

第三次用LIPO3000,做细胞爬片,三组均无荧光

第四次,考虑可能细胞状态不好,重新复苏了一批HEK293,第四代传代时行转染

转染方法如下:六孔板,gibico  OPTI-MEM,  LIPO2000

质粒浓度  0组500ng/ul   1组900ng/ul  2组 900ng/ul

质粒使用OMIGA无内毒素小提试剂盒提取

LIPO2000 10ul      OPTI-MEM150ul  混匀 室温静置5min

DNA 3.5mg            OPTI-MEM150ul混匀  室温静置5min

然后上述试剂再混匀,室温静置20min

准备传代 传代时铺六孔板,增大细胞密度,同时加入转染试剂

6小时后观察,虽然细胞死亡较多,但仍有不少细胞贴壁,遂换液,36小时时换液,

48小时细胞融合达80%,70h时,于荧光显微镜下观察0组有荧光,1、2组无荧光。

昨日继续采用LIPO2000,说明书上方法,传代后待细胞融合至60-70%转染。并且同时用PEI转了一批细胞,明天再继续观察有无荧光。

质粒是找公司构建的,如果是质粒问题,还需要重新构建质粒,又得等上几个月,好伤心,好伤心。

可不可以在荧光显微镜下观察无荧光后,提蛋白,跑WB 看有没有GFP表达? 


是转染方法、转染试剂的问题?


精准对接
一等奖

投稿人: 李博

您无权查看 !

一等奖

投稿人: 思雨

您无权查看 !

投稿人: 清风有信

您无权查看 !

投稿人: 往圣科技

您好!我是广州往圣生物科技有限公司的!我公司质粒转染做的也很多的。您这边现在实验周期长,时间比较紧张。重新构建质粒速度是很慢的。我们这边提供相应的实验技术支持,有问题可以随时进行沟通。技术服务人员电话:18998395636(微信同号),无论是转染的,还是其他问题,都可以随时咨询!

投稿人: 往圣科技

附件:

好!我是广州往圣生物科技有限公司的!我公司质粒转染做的也很多的。您这边现在实验周期长,时间比较紧张。重新构建质粒速度是很慢的。我们这边提供相应的实验技术支持,有问题可以随时进行沟通。目前通过CRISPR/CAS9技术,批量将质粒导入到细胞中,完全实现了一次性敲除2万个基因(基因敲除),一次性激活2万多个基因(过表达),一次性激活1万多个lncRNA(lncRNA过表达)。详细处理原理见附件,也可以跟我公司技术人员联系,相互交流。 技术服务人员电话:18998395636(微信同号),无论是转染的,还是其他问题,都可以随时咨询!

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