_￥10.00 蛋白上样量指的是每个孔的上样蛋白浓度吗？

你好，请问你询问的是western lot实验中的蛋白上样量吗？一般指的是每个孔的样品的蛋白总量。例如，你测得的样品蛋白浓度为2μg/μl，如果要上总蛋白30μg，则需要你的样品15μl。WB实验中要求每个孔的上样量一致，所以如果单个蛋白样品浓度不一致的话，所上的样品体积就不一样，因此需要用1X的上样buffer 补齐上样总量。

比如有三个样品，总上样量为30μg，计算上样体积（例1）：

上样之前，把样品和1x buffer在EP管中先混合均匀，然后统一点样。

首先，western每个孔蛋白的上样量指的是蛋白的质量，即每孔保持相同的蛋白质量；同时，也要保证每孔的体积一样，这样跑出来的条带才会一致，而且非常漂亮。因为浓度的不同，上相同质量的蛋白时体积肯定是不同的，这时用裂解液和loading buffer补充（注意是和不是或），即保证每个空的loading buffer都是一样的量，剩下的用裂解液补充即可。 你会发现每次跑的条带特别整齐且非常漂亮。

关于电压为什么跑着跑着变成恒流了，我也遇到过类似的问题，这个和缓冲液还有电泳仪有关，但不用特别纠结，每次用新的缓冲液转膜，尽量不要用回收的。

转膜时电压上不去很正常，我一般200mA恒流时，电压在140v左右，但是后期慢慢会降，不必纠结。

总结一下，第一，跑胶时每孔上同样质量的蛋白且保证同样体积；第二，不必纠结转膜时电压为何上不去，本身就是放热的过程，但转膜时尽量用新的转膜液。

补充一下，小蛋白（30kDa一下）尽量低电流短时间转膜，否者会跑出去，0.22PVDF膜或NC膜，最好封闭过夜；大蛋白可以时间长一些，但要自己摸索时间。