乳酸曾被认为是糖代谢过程无用的副产物，后续研究中发现乳酸在诸多分子机制的调控中起重要的调节作用，包括调控巨噬细胞极化、辅助T细胞分化以及肿瘤细胞免疫监控的调节。到目前为止，没有确定乳酸的直接蛋白质靶标，乳酸是否通过直接蛋白质靶向参与其他细胞内信号转导和生物学分子机制仍有待确定。视黄酸诱导基因I样受体(retinoic-acid inducible gene I -like receptor, RLR)可介导干扰素（IFN）的生产，作为先天免疫的重要组份对病毒清除和癌症免疫监视等方起关键作用。然而，乳酸对调节免疫细胞功能发挥的作用，以及乳酸是否参与RLR信号介导IFN的机理仍然不清楚。2019年5月，军事医学科学院生物医学分析中心张维娜课题组最近与美国维克森林大学Hui-Kuan Lin合作在国际顶级期刊Cell发表学术论文：Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS，发现乳酸竟然是靶向MAVS的RLR天然抑制剂，并阐明了乳酸参与RLR信号介导IFN的机理。
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     研究人员发现，糖酵解产物在RLR活化期间阻碍IFN的产生，RLR触发MAVS-RIG-I识别己糖激酶，使己糖激酶与线粒体抗病毒信号传导蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)结合，导致己糖激酶的亚细胞定位和激活受损。研究还发现，乳酸通过直接结合MAVS跨膜（TM）结构域，阻止MAVS聚集从而抑制RLR介导的信号传导。通过引入乳酸脱氢酶抑制剂调节乳酸脱氢酶的水平，发现当乳酸脱氢酶A（LDHA）失活导致的乳酸减少时，会增加I型IFN的产生，从而保护小鼠免受病毒感染。另外，炎症状态下，乳酸的补充可逆转由乳酸缺乏引起的IFN产生增加。此研究确定了糖酵解衍生的乳酸在限制RLR信号传导中的关键作用，并将MAVS鉴定为乳酸的直接传感器，可作为能量代谢和先天免疫的枢纽。
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     在实验中，研究人员采用siRNA沉默若干乳糖代谢相关基因（如：单羧酸转运蛋白MCT1、己糖激酶HK、乳酸脱氢酶LDHA等）转录水平的表达以研究乳糖与IFN、MAVS的作用关系 （siRNA: human MCT1来自于锐博生物的genOFF文库产品，货号为stB0007914A和stB0007914B）。
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     通过siRNA:human MCT1 对MCT1m RNA进行干扰，以阻碍细胞对乳酸的摄取和转运，细胞水平为例，对照组中格外添加lactate的组较野生型IFN显著下调，而SiRNA干扰MCT-1的两平行组则无变化；在mRNA转录水平，qPCR检测两平行组均可降至20%左右，显著性分析p < 0.01。可见，siRNA对MCT-1的干扰效果显著，阻碍细胞对乳糖的摄入，为乳糖干扰IFN表达提供直观的证据。
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1.通过LDHA揭示乳糖对RLR信号干扰
     乳糖脱氢酶LDHA是无氧糖酵解的关键酶，可催化丙酮酸生成乳酸。通过应用遗传和药理学方法探究LDHA相关乳酸是否在负调节I型IFN中发挥作用。结果表明，LDHA的敲低增强了TBK1和IRF3的磷酸化并增强RLR激活后的IFN-β产生（下图A-D）。与LDHA敲低类似，使用LDHA抑制剂草氨酸钠（sodium oxamate）可降低乳酸水平并增强IFN-β产生，从而抑制病毒复制（下图E-H）此外，向草氨酸钠处理的细胞中添加乳酸阻碍LDHA抑制剂对IFN-β促进的作用（下图I）。乳酸的添加破坏了2-DG对IFN-β诱导及其上游信号传导的影响（下图J）。在己糖激酶HK敲低的细胞中也观察到类似的结果（下图K）。研究中还发现乳酸的添加恢复了半乳糖对IFN-b诱导和病毒复制的影响（下图L）。
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LDHA敲低后对(A)乳糖的影响 (B)INF-β转录水平的影响 (C) INF-β蛋白水平的影响 (D)修复LDHA对INF-β转录水平的影响;添加LDHA抑制剂草氨酸钠后对 (E)乳糖的影响 (F)INF-β转录水平的影响 (G)Sev病毒侵入下INF-β转录水平的影响 (H)对入侵病毒Sev复制的影响;细胞中添加乳酸前后（I）草氨酸钠对IFN-β转录水平的影响（J）乳糖对2DG诱导IFN-β的影响（K）己糖激酶敲低下对IFN-β的影响（L）半乳糖对对IFN-β的影响

2. LDHA生产的乳酸通过靶向MAVS负调节RLR激活
     为确定乳酸对RLR信号传导的作用的直接靶标，研究中利用生物素标记的乳酸进行测定；主要专注于参与RLR信号传导激活的关键蛋白（包括RIG-I，MDA5，TBK1，MAVS和IRF3）发现乳酸与MAVS存在特异性相互作用（下图A）、MAVS在不同生理条件下与乳酸盐相互作用（图B和C）。
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(A)免疫印迹分析生物素标记的乳酸结合物  (B) 荧光分析细胞的IgG及mavs抗体对乳酸相互作用 (C)荧光分析细胞的IgG及mavs抗体对乳酸相互作用丙酮酸相互作用
     为了探索乳酸和MAVS之间的详细相互作用，研究人员对其结构域进行分析，发现乳酸-MAVS的结合需要MAVS中的TM结构域，通过合成MAVS的TM结构域（514-535aa）并对其N末端加上一段TAT标签。在体外实验中发现TM肽能够有效中断乳酸与MAVS的结合。体内实验，通过人免疫缺陷病毒TAT中TAT肽的细胞穿透性（CPP）将大分子送到细胞中以测试它们的生物学功能。利用CPP将TM肽送进入细胞内使用免疫荧光观察（下图J）确定了TM肽对RLR诱导的I型IFN产生的影响。此外，向细胞中添加TM肽可促进RLR活化（下图K）并阻碍乳酸对IFN-b和IL-6产生的抑制作用（下图L）。
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(A)MAVS染色TAT抗体染色，免疫荧光分析TM肽作用(B) TM肽转染细胞后IFN-β表达的qPCR分析（C）qPCR分析经草酸钠、TM肽、乳酸对细胞IFN-β表达的影响
这些结果表明乳酸通过其与MAVS的TM结构域的结合来抑制RLR信号传导。
3. 乳酸抑制MAVS线粒体定位、RIG-I-MAVS和MAVS聚合
    为进一步揭示乳酸抑制RIG-I-MAVS诱导RLR活化的潜在机制，研究人员增加草氨酸盐（乳酸脱氢酶抑制剂）抑制乳酸产生后， MAVS线粒体定位清晰，而添加乳酸后破坏了这种现象（图A和B）。另外MAVS的TM结构域缺陷型不能在线粒体中定位且不能与活化的RIG-I相互作用（图C）。
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(A)免疫荧光分析乳酸/草氨酸对MAVS的细胞定位的影响 (B)体免疫印迹分析乳酸/草氨酸对MAVS的细胞定位的影响 （C）体免疫印迹分析TM结构对RIG-I相互作用
   为探究乳酸对RIG-I MAVS的影响，研究中通过活化的RIG-I诱导体外MAVS聚集测定，并将乳酸盐与活化的RIG-I蛋白及线粒体一起孵育。结果显示当存在线粒体和K63连接的泛素链（K63-Ub4）的情况下，纯化的GST-RIG-I（N）在体外触发了显著的MAVS聚集。另外，乳酸拥有显著阻碍MAVS聚集的能力（图F）。
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(图F)体外MAVS聚集的免疫印迹分析
总之，本研究发现乳酸可靶向MAVS的TM结构域以阻碍其线粒体定位和RIG-I-MAVS复合物形成，从而损害MAVS聚集及其下游信号传导激活，证明MAVS与乳酸的结合使MAVS线粒体定位破坏，从而减弱RLR信号传导和下游I型IFN产生。文中讨论部分提及癌细胞逃避免疫机制监视的一个潜在机制可能与乳酸限制I型INF的产生有关，并为各种人类疾病（如病毒感染和癌症）调控提供了重要的理论依据和策略：将MAVS的TM肽应用于治疗中，不仅可以提高正常条件下IFN的产生，而且可以减轻乳酸对RLR介导的IFN产生的抑制作用；此外，有望通过靶向乳酸脱氢酶的药物，抑制乳酸的生产以加强宿主先天免疫反应，提高I型干扰素生产来病毒清除和癌症免疫监测。
详情请查阅原文：Weina Zhang, Guihua Wang, Zhi-Gang Xu et al., Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS [J] Cell 178, 1–14 https://doi.prg/10.1016/j.cell.2019.05.003来源：锐博生物