【老司机的生物学课堂】染色体外DNA（上篇）：原癌基因的载体

文|吴思涵

前言

DNA存在于真核细胞的哪些位置呢？如果你学习过高中生物，应该可以很轻松地回答：细胞核、线粒体、叶绿体。

绝大多数DNA位于细胞核之中。按照目前所有教科书的说法，在真核细胞的细胞核中，DNA一圈圈缠绕在组蛋白上，形成具有高级结构的染色体。所以一直以来我们都有这样的基本认知：核DNA全部位于染色体中。

然而事实却并非如此完美。

在特殊情况下（这里排除病毒感染等外源核酸的入侵），核DNA是有可能从染色体上脱离开来的。比如说，由于电离辐射、紫外线等因素，造成DNA双链断裂。通常情况下，我们的细胞会有相应的修复机制，将缺失的DNA补回去，将废掉的DNA排出细胞外。假设损伤过大，无法修复，细胞也会启动死亡机制，避免表达错误的基因，也避免将错误的遗传信息传递给子代细胞。

不过，这个世界上却有一类特立独行的细胞。它们的遗传信息出现了错误，既不好好修复，又不想去死，让我们十分为难。而这一类细胞便是我的研究对象——肿瘤细胞。

最近，我们实验室在Nature上发表了一篇有关肿瘤细胞染色体外DNA（extrachromosomal DNA，简称ecDNA）的文章：Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity。（传送门 http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21356.html）借此机会，本专栏将连续推出3篇文章，给各位读者介绍肿瘤ecDNA的方方面面。

一、倍体异常和基因扩增是恶性转化细胞的共性

早在1842年，瑞士植物学家Carl Wilhelm von Nägeli率先观察到染色体的存在，从而奠定了细胞遗传学的基础。然而直到百余年后的1956年，科学家们才正式确定，人类体细胞具有46条染色体。不过在正式确定染色体数目之前，已经有不少致力于观察人类肿瘤染色体的研究，并得到一致的结论：恶性转化细胞，或者说肿瘤细胞，其染色体数量和正常细胞的是不一致的，通常是非整倍体地增多。如下图是一篇很早期的文献，报道了人脑胶质瘤有81条染色体。

染色体数量的增加，意味着基因拷贝数的增加。如果刺激生长的基因数量增加了，那么这个细胞的增殖就容易失控，并在复杂的多基因相互作用及环境选择的驱动下，演化成肿瘤。比如说，许多上皮型肿瘤的7号染色体往往会增加，而这条染色体携带了驱动这一类型肿瘤的EGFR基因（表皮生长因子受体）。

染色体数目增加，是否就是肿瘤细胞原癌基因拷贝数增加的唯一机制呢？其实不是。在肿瘤细胞混乱的核型之中，其实埋藏了许多基因扩增的可能性。

二、染色体外DNA携带扩增的原癌基因

在研究肿瘤核型的时候，科学家们发现了很奇怪的现象。除了染色体数量非整倍增加之外，还可观察到：1、染色体外还有许多能够被染料着色的小点；2、带型染色时，会发现部分染色体呈现大面积的明带或暗带。

如下图A和B，我们可以发现染色体外还存在一些或大或小的染色信号。图C则可以发现，染色体有异常长的明带。

图A和B的那些小点到底是什么？是染料中的杂质吗？是制备样本时不小心把染色体打碎了吗？答案是否定的，因为用同样的方法制备正常细胞的样本时，却没有发现这些小点的存在，说明这并不是技术错误导致的。而图C的大面积异常的带型，也并非是制备样品时把几条染色体黏在一起了。在荧光显微技术，以及荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）发展起来之后，我们终于明白，原来这里面蕴藏着大量的原癌基因拷贝。

比如说上图这个肿瘤细胞系，我们用DAPI（蓝色）来染DNA，用红色的FISH探针来染原癌基因EGFR，用绿色的FISH探针来标记人类7号染色体。（注：EGFR基因位于7号染色体。以及这张图出自我们实验室。）

可以发现，只用DAPI标记DNA，同样可以在左边的样本中观察到许多游离于染色体外的小点，即ecDNA。通过FISH探针可以发现，几乎所有的ecDNA都包含了EGFR基因。右边的样本，EGFR基因的信号则“挤”在一起，形成强染色区域。这也是在做核型染色时会出现连续大面积的明带或暗带的原因。我们把这样的染色区域称为homogeneously staining regions（HSR，均匀染色区）。值得注意的一个现象是，HSR上的EGFR基因，绝大部分不在7号染色体上，而是插到别的染色体，或者自成一体了。

三、ecDNA普遍存在于肿瘤细胞中

我们不禁要问，ecDNA这种现象，是不是肿瘤细胞所特有的？又是否为肿瘤细胞的共性？如下图所示（第三节的图都出自那篇Nature文章，不逐一标注来源了），我们统计了来自143个样本、共计2572个me taphase有丝分裂中期核型（只有制备有丝分裂中期的核型才可检测ecDNA），发现正常细胞的me taphase中极少出现ecDNA，永生化细胞的me taphase存在ecDNA的比例增高，恶性转化肿瘤细胞me taphase的ecDNA比例更高。

（注：这种图叫做beanplot，中文名姑且称为豆荚图。它是传统box plot箱式图的升级版，既展示了所有数据的分布范围——可展示最大值和最小值，又在水平方向上展示数据的相对分布频数——越“胖”则相对频数越高。据我所知，目前可用R语言来生成beanplot。）

假如把受检的me taphase按照癌种分类，我们可以看出，不同肿瘤细胞类型中ecDNA的比例和数量是不同的。比如结肠癌细胞系me taphase的ecDNA比例低、数量少，而脑肿瘤GBM的ecDNA比例高，数量多。

在每个样本至少统计20个me taphase的情况下，如果将超过10%的me taphase出现不少于2个ecDNA的样本，定义为ecDNA阳性样本，并重新绘制一张如下的统计图（蓝色阴性，红色阳性），我们可以看到，正常细胞极少阳性，而在传统的肿瘤细胞系（established cell line）中，有接近40%存在ecDNA。在PDX，也就是patient-derived xenograft原代异位移植瘤中，近90%的样本是ecDNA阳性。

同样地，按照癌种来划分的话，不同类型的肿瘤，ecDNA阳性的比例也不同。如下图所示：

此外，还有一个值得重视的现象：对于一个细胞群体来说，不同细胞携带ecDNA的数量是不同的。有的细胞，可能完全没有ecDNA，而有的细胞，可以携带几十甚至上百个ecDNA。通过直方图我们可以看出，在细胞群体中，单细胞中ecDNA数量的分布可能呈正态分布，也可能呈偏锋或双峰分布。

结合新一代测序和FISH实验，我们进一步证明，常见的扩增原癌基因普遍位于ecDNA，包括仅存在于ecDNA和共同存在于HSR。至此我们可以得出结论，携带原癌基因的ecDNA广泛存在于肿瘤中，并具有复杂的分布方式。而正常细胞几乎不存在ecDNA。

四、为什么ecDNA直到近年才得到重视？

或许各位读者并不清楚，早在1962年，科学家就获得了第一张疑似肿瘤细胞存在ecDNA的照片，并于1965年正式在肿瘤细胞中确认ecDNA的存在（当时的叫法是微型染色质小体minute chromatin bodies，这里minute的读音是/mainju:t/，而不是/minit/）。

读到这里，你是不是也很疑惑：为什么如此普遍的现象，却一直没有受到足够的重视？按道理这种几十年前的发现，早就应该被写进教科书了，为何在我们本科甚至研究生的细胞、遗传学等学科的课堂上，相关知识却鲜被提起？而在肿瘤研究领域，尽管在上世纪60年代以后陆续有证据支持，这些ecDNA携带着原癌基因，但却甚少有研究去探讨为何ecDNA会在肿瘤演化中被选择出来，对肿瘤有什么意义。是因为ecDNA并不是什么重要的东西吗？其实不是。我们对此的理解是，新技术的诞生，反而让科学家忘记去思考一些最基本的问题。

提到研究原癌基因的拷贝数，不知各位首先会想到什么方法？

我想绝大多数人的第一反应是：设计引物做一下qPCR，或者干脆直接上测序。FISH？这么老土又费力的方法，才懒得去做，只有诞生在几十年前没有PCR更没有测序时代的长者才会去用吧。

我承认我以前也这么naive过。没错，测序技术的发展，我们对基因组的研究精度是越来越高，分辨率早就到达单碱基水平了。但是，这种序列分辨率的提升，却牺牲了空间分辨率——我们越来越搞不清楚，测出来的某一段序列，到底位于基因组的什么位置。

这时候可能有人跳出来尝试打本司机的脸说，人类基因组早就不知道测完多少年了，现在拿到测序数据后，只要mapping回去就知道是染色体的什么位置了。但我们要明白的是，人类基因组计划测的是健康人的基因组，默认46条染色体不多不少。可是在肿瘤中却有ecDNA的存在，而测序在mapping的时候可不管那么多。因此我们经常会发现，现在的测序数据得到的基因扩增图谱，就是一段染色体，上面画一些高高低低的曲线，代表扩增或者缺失的区域，但却鲜有人去问，扩增出来的序列，到底扩增到哪里去了，或者干脆默认多份串联排列在同一条染色体上了。（如下图所示，扩增在ecDNA与扩增在HSR的EGFRvIII基因，通过测序绘制出来的图谱几乎是一样的，但通过老土的FISH方法却能得知两者的空间定位不同。所以说，要听长者的话。）

第二个原因是，传统肿瘤细胞系（established cell line）在过去几十年间成为了绝对主流的研究对象。然而我们的研究却指出，这类经多次传代的established cell line，仅有40%是ecDNA阳性的，而在PDX模型中却高达90%。这说明，研究对象的“先天”不足，也可能导致ecDNA受到忽视。近几年，肿瘤领域支持使用PDX或原代球培养PDC（patient-derived cell）的呼声越来越高，并指出established cell line的各种缺陷，我想，以后应该会有越来越多的科学家加入ecDNA的研究队伍之中。

还有一个可能的原因是技术的限制。研究ecDNA必须观察有丝分裂中期me taphase的核型。而制备me taphase必须使用处于有丝分裂的细胞，因此无法直接在组织块中研究，而须先进行原代分离培养。而一旦使用传统的建系方案而非近几年推崇的无血清球培养方案，则变成了established cell line，有可能丢失ecDNA。此外，制备me taphase的步骤也比较繁琐，并不是每个人都愿意去做。

小结

这一篇文章，本司机向大家介绍了蕴藏着原癌基因的染色体外DNA。原来，肿瘤扩增原癌基因，并不仅仅是通过扩增染色体数目、或者串联排列在同一条染色体上来实现的，而可以存在于ecDNA和HSR。有了ecDNA的机制，每个肿瘤细胞可以获得高达上百个拷贝的原癌基因。

除了可以拥有更高的拷贝数之外，利用ecDNA来承载原癌基因还有什么优势呢？敬请期待下一篇文章的讲解。

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（知乎栏目：老司机的生物学课堂）

文 | 吴思涵

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