Nature重磅丨抗miR-17寡核苷酸RGLS4326用于治疗多囊肾的发现和临床前评价-肽度TIMEDOO

常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是由PKD1或PKD2基因突变引起，也是人类最常见的单基因疾病之一，也是终末期肾脏疾病的主要遗传原因。ADPKD临床特征是因大量充满液体的囊肿，使肾脏逐渐进行性双侧肿大，而PKD1或PKD2基因突变导致肾小管上皮过度增殖，从而导致囊肿形成。全球超过1200万人患有ADPKD，使其成为最常见的单基因疾病，到60岁百分之五十的ADPKD患者最终会发展为终末期肾病（ESRD），分别占欧洲和美国ESRD患病患者的10％和5％。不幸的是，这种威胁生命的疾病的治疗选择仍然非常有限。
美国Regulus Therapeutics公司的Edmund C. Lee和德克萨斯大学西南医学中心的Vishal Patel等科学家最近在Nature Communication发表了题为Discovery and preclinical evaluation of anti-miR-17 oligonucleotide RGLS4326 for the treatment of polycystic kidney disease的文章，通过miRNA文库筛选发现了用于ADPKD的潜在治疗的RGLS4326，一种microRNA-17（miR-17）的first-in-class的短寡核苷酸抑制剂，它优先分布于肾脏并收集源自导管的囊肿，从翻译活性多核糖体中置换出miR-17，并抑制多种miR-17 mRNA靶标，包括Pkd1和Pkd2。该抑制剂在动物实验中表现了良好的临床安全性和治疗效果，有望成为ADPKD治疗的一种有效且理想的方法。

什么是miRNA及其治疗途径？

miRNA是进化保守的约20个核苷酸长（nt）的非编码RNA，可作为基因表达的转录后抑制剂。种子序列（主要位于miRNA的5'端N2-至N8核苷酸（N）位置）和互补序列（主要位于3'非翻译区（3'UTR）之间）的Watson-Crick碱基配对mRNA）导致目标mRNA转录物的翻译抑制和最终降解。miRNA异常激活可促进多种人类疾病的发展，与特定病原性miRNA完全互补的18-21nt的长抗miR已被证明可以减弱疾病的进展。近年来，miRNA抑制已成为一种有吸引力的治疗策略，经过化学合成和修饰的单链寡核苷酸抗microRNA（anti-miRs）可抑制miRNA并抑制下游靶标mRNA和编码蛋白。
研究人员发现， miR-17 miRNA家族在人和鼠形式的ADPKD中均被上调，并且它们的缺失或抑制减弱了小鼠PKD模型中的囊肿生长。miR-17家族源自三个多顺反子簇：miR-17〜92，miR-106a〜363和miR-106b〜25簇。在这三个基因中，miR-17〜92对胚胎发育至关重要，并以其作为癌基因的作用而闻名。miR-17〜92的种系敲除会导致围产期致死，并伴有骨骼，心脏，肺和B细胞的成熟缺陷，而miR-106a〜363或miR-106b〜25簇的缺失不会产生任何明显的异常。在肾脏内，小鼠肾脏祖细胞中的miR-17〜92缺失会损害肾脏的生成24。然而，这些簇的表达随着成熟而下降，因此，成年小鼠中miR-17〜92的诱导型缺失除了降低成熟造血谱系外，不影响其寿命或总体健康状况。肾脏特定的miR-17〜92簇缺失也不会在肾脏的形态和组织学上产生任何明显的缺陷。因此，在产后肾脏中优先靶向miR-17家族是治疗ADPKD的一种有吸引力的治疗方法。

如何发现抗miR-17寡核苷酸RGLS4326？

研究人员通过筛选抗miR-17寡核苷酸化学多样性的文库来发现RGLS4326，以获得最佳药物特性，包括功效、稳定性、安全性、药代动力学-药效学特征以及全身给药后可优先分配至肾脏并赋予治疗功效的能力。该文库包含> 190个不同长度的寡核苷酸，碱基序列（针对成熟miR-17的位置互补）和化学修饰。将HeLa细胞与萤光素酶报道载体和外源性miR-17表达载体共转染，载体起抑制萤光素酶信号的作用，再分别用文库中的抗miR-17寡核苷酸分别处理HeLa细胞，螯合miR-17和抑制荧光素酶信号。
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图1. 发现RGLS4326的过程：一种化学修饰的miR-17寡核苷酸抑制剂

RGLS4326抑制miR-17并抑制直接的mRNA靶标

RGLS4326在HeLa细胞中抑制miR-17功能并降低其miR-17荧光素酶传感器的活性，EC50值为28.3±4.0±nM。正如其与miR-17家族种子区域的序列互补性所预期的那样，RGLS4326还抑制了其他miR-17家族成员（包括miR-20b，miR-93和miR-106a）的萤光素酶传感器活性，但不是无关的miRNA，例如miR-33b。除了常用的萤光素酶传感器分析，通常通过测量单个下游靶基因的去阻抑来评估miRNA的功能抑制。单个miRNA靶基因的变化通常很小，很大程度上取决于细胞类型。
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图2. RGLS4326抑制miR-17并抑制直接miR-17靶标。

RGLS4326抑制人类原发性ADPKD囊肿生长和优先分布于肾脏

通过利用来自人类ADPKD供体的原代囊肿培养物，观察到在RGLS4326处理的非ADPKD肾细胞中没有miR-17抑制明显的细胞毒性。接下来，研究人员评估了单次30μmg/ kg-1 SC注射后，RGLS4326在野生型小鼠中的体内药代动力学和生物分布特征。RGLS4326被迅速吸收到血浆中，表现出Tmax≤1h，Cmax 8.5μgmL-1，半衰期<4 h。值得注意的是，RGLS4326表现出优先的肾脏分布，Cmax和AUClast分别显示肾与肝（K / L）的比率分别约为13和8。定量全身放射自显影（QWBA）研究的数据进一步证明，在单次SC给药后，RGLS4326主要分布在肾脏上，而大部分给药剂量在尿液中消除了。在肾脏中，已知化学修饰的寡核苷酸主要通过基底外侧摄取和肾小管重吸收而定位于近端小管，而肾小球的定位极少。
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图3. RGLS4326的药代动力学、组织分布和药效学特征

RGLS4326改善PKD中失调的基因网络表达

为了进一步了解PKD治疗中RGLS4326的作用机制（MOA），研究人员首先比较了RGLS4326治疗后的Pkd2-KO和Pcy / CD1模型中的肾脏总体mRNA表达谱与各自的PBS-处理过的对照组。研究发现，RGLS4326治疗在两个PKD模型的囊性肾脏中均具有显着的转录组范围影响，并且全局抑制了预期的miR-17靶基因的mRNA。
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图4. RGLS4326改善PKD模型中失调基因网络的表达

RGLS4326的临床前安全性评估

研究人员接下来对RGLS4326的临床前安全性进行了评估。由于含有2'-脱氧-2'-氟核苷的寡核苷酸具有抑制DNA修复和诱导线粒体毒性的潜力，实验评估了包含三个2'-脱氧-2'-氟核苷的RGLS4326的遗传毒性和线粒体毒性潜力。每天三剂最高剂量达2000 mg kg-1的小鼠在细菌诱变分析、体外人淋巴细胞微核分析或体内微核和彗星分析中均未观察到遗传毒性。在需要线粒体氧化代谢的条件下，人体细胞体外实验也未观察到线粒体毒性，而在体内，通过电镜检查注射了RGLS4326的猴子的肝脏和线粒体心脏组织也未观察到线粒体毒性。
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图5. RGLS4326不会对猴子造成造血或肾脏毒性。

研究结果及意义

与传统药物相比，基于miRNA的药物具有独特的MOA。miRNA同时抑制许多mRNA靶标，从而影响多种信号通路。此外，miRNA起到变阻器的作用，而不是通断开关。传统药物通常会抑制（或激活）单个或几个途径，而基于miRNA的治疗剂可以全面调节多个途径。
此项研究表明，RGLS4326处理可改善PKD中许多致病基因网络和途径的表达。重要的是，这种多囊肾转录组向正常肾脏分布的协调重新布线，说明了RGLS4326作为ADPKD疾病缓解疗法的潜力。RGLS4326最吸引人的功能之一就是它与ADPKD的潜在直接机械联系。研究表明，miR-17与PKD1和PKD2的3'UTR结合并抑制它们的表达。显而易见，抗miR-17寡核苷酸RGLS4326具有良好的效价、稳定性、安全性、药代动力学和药效学特性，包括优先分配至肾脏，在体内可在多种PKD小鼠模型中有效，该研究有力地支持了针对ADPKD的RGLS4326的临床开发。
来源：锐博生物
原文链接：Edmund C. Lee, et al. Discovery and preclinical evaluation of anti-miR-17 oligonucleotide RGLS4326 for the treatment of polycystic kidney disease. Nature Communications, volume 10, Article number: 4148 (2019)

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-11918-y