非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）已成为全球关注的主要公共健康问题。该疾病目前影响了西方国家总人口的20-35％，并且10％的患者可以从良性脂肪变性发展为更严重的疾病，包括脂肪性肝炎、肝硬化和肝衰竭。此外，多项证据表明NAFLD与亚临床动脉粥样硬化的多种标志物之间有很强的相关性，而与传统危险因素无关。因此，NAFLD的不良反应不仅局限于肝损伤的恶化，而且还为动脉粥样硬化和其他相关心血管疾病（CVD）的发生提供了独立风险。动脉粥样硬化被认为是由脂质异常积累和炎性细胞在血管内皮浸润引起的一种慢性炎性代谢疾病。动脉粥样硬化形成的第一步是内皮损伤和功能障碍。临床和实验数据均表明NAFLD、内皮功能障碍与CVD之间存在密切关联，但其潜在机制尚不清楚。
NAFLD和CVD之间的联系揭示了细胞间通讯在疾病致病过程中的重要性。众所周知，细胞不仅可通过直接接触和可溶性因子进行通信，而且还可通过膜衍生的纳米大小的囊泡，即细胞外囊泡（EVs）进行通信。EVs携带大量供体细胞衍生的分子，包括蛋白质、脂质和核酸。通过将这些生物活性成分转移到靶细胞中，EVs在细胞间通讯中起着至关重要的作用。EVs在包括肝脏疾病在内的生理或病理条件下释放，并对靶细胞产生广泛的影响。在各种分子中，miRNAs被认为是EVs功能的重要组成部分。miRNAs作为EVs的重要载体，已成为各种疾病（包括NAFLD和CVD）发病机制的关键调控因子。
为了探讨NAFLD状态下肝细胞来源的细胞外囊泡（EVs）在内皮炎症和动脉粥样硬化形成中的潜在作用。最近，复旦大学附属中山医院夏朴教授课题组在Journal of Hepatology（IF18.946）期刊上发表了题为Hepatocyte-Derived Extracellular Vesicles Promote Endothelial Inflammation and Atherogenesis via microRNA-1的研究论文。发现肝细胞来源的EVs通过microRNA-1下调KLF4并激活NF-κB通路来促进内皮炎症和动脉粥样硬化的发生。揭示了肝脏与血管之间远距离通讯的新机制，并提出了预防和治疗CVD，尤其是NAFLD患者的新方法。为了鉴定在脂肪变性条件下从肝细胞释放的EVs，研究人员采用了一种常见的肝脂肪变性细胞模型，其中肝细胞长期暴露于饱和游离脂肪酸棕榈酸（PA）。然后通过超速离心从细胞培养基中收集了EVs，并通过纳米粒径追踪分析（NTA）和透射电镜对它们进行表征。发现EVs的粒径分布为30-200nm，PA处理可使Huh7肝细胞释放的EVs增加近10倍，并且还略微增加了EVs的平均尺寸。此外，EVs富含外泌体的特征性标志物，包括Tsg101、CD63和CD81，而没有表达与其他细胞器相关的蛋白质。表明收集到的大多数EVs可能是源自肝细胞的外泌体。脂肪变性肝细胞来源的EVs的功能研究：诱导内皮细胞炎症损伤为了研究EVs在肝细胞与血管内皮细胞相互作用中的作用，研究人员首先检测了内皮细胞是否可以摄取肝细胞来源的EVs。结果发现内皮细胞可有效吸收肝细胞来源的EVs，并且脂肪变性肝细胞来源的EVs也更倾向于递送到内皮细胞。然后研究人员评估了EVs对受体内皮细胞的影响。发现PA处理的EVs（PAEV）上调的前10个基因主要与内皮炎症有关，包括E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β和MMP-1。此外，p65磷酸化和IκB降解也显著增加，暗示NF-κB通路被激活。之后，研究人员通过NF-κB特异性报告基因实验验证了肝细胞来源的EVs对NF-κB活化的影响。研究发现PAEV处理可显著增加报告基因活性，进一步证明了NF-κB通路是由脂肪肝细胞来源的EVs所激活。为了进一步阐明脂肪变性肝细胞来源的EVs对内皮细胞的影响，研究人员从HFD诱导的肥胖（DIO）小鼠中分离了原代肝细胞，然后与小鼠主动脉内皮细胞共培养。发现与脂肪肝衍生的肝细胞共培养导致E-selectin、ICAM-1和VCAM-1表达以及NF-κB活化显著增加。而用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869（可有效阻断EV释放）对肝细胞进行预处理，几乎完全消除了与脂肪肝衍生的肝细胞共培养对内皮细胞的影响。表明脂肪变性肝细胞通过释放EVs可有效地促进内皮炎症。EV miRNA表达谱分析：确定EVs促炎作用的相关因子miR-1为了确定EVs促炎作用的相关因子，研究人员通过miRNA测序（EVs miRNA测序服务由锐博生物提供）对DIO和正常对照小鼠原代肝细胞来源的EVs（DIOEV和NCEV）进行miRNA表达谱分析。发现在差异表达的miRNAs中，miR-1簇（包括miR-1a-3p和miR-1b-5p）在DIOEV中上调最显著。在DIO小鼠总肝脏组织和原代肝细胞中也观察到miR-1表达升高，但是miR-1在DIOEV中的上调程度要高于肝组织和肝细胞，表明miR-1在脂肪变性肝细胞来源的EVs中选择性富集。此外，人类miR-1（miR-1-3p、miR-206和miR-1-5p）在经PA处理的人类Huh7肝细胞衍生的EVs中也显著升高。表明脂肪变性肝细胞改变了EVs中的miRNA表达谱，显著上调了miRNA-1的表达。考虑到脂肪变性肝细胞来源的EVs的促炎作用和EVs中miR-1的显著上调，研究人员猜想miR-1是否也可模拟EV诱导的内皮炎症。结果发现在TNFα刺激下，过表达miR-1或miR-206可导致E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白水平显著增加，同时TNFα诱导的NF-κB活化和单核细胞在内皮细胞上的粘附也显著增加，说明miR-1具有很强的促炎作用。接着，研究人员通过生物信息学分析在KLF4的3’UTR中发现了一个miR-1结合位点。过表达miR-1或miR-206可显著下调KLF4的表达。而过表达KLF4可极大地消除miR-1诱导的VCAM-1表达，下调KLF4的表达则能够模拟并增强miR-1的作用。此外，将miR-1 mimics与KLF4 3’-UTR报告基因共转染可显著降低荧光素酶活性，证实了miR-1对KLF4的直接作用。在证实了miR-1的促炎作用后，研究人员推测EV来源的miR-1在脂肪变性条件下介导了肝细胞诱导的内皮炎症反应。因此，研究人员首先将Cy3标记的miR-1 mimic转染到Huh7细胞并与HUVECs共培养，发现荧光染料在HUVECs中明显积累。此外，miR-1定量分析显示内皮细胞中几乎未检测到内源性miR-1表达，但在共培养后其表达显著升高。而通过GW4869阻断肝细胞EV的释放可消除HUVECs中miR-1的增加，表明肝细胞通过释放EVs将miR-1递送到内皮细胞。接着，研究人员将HUVECs暴露于PAEV出现了类似的miR-1表达水平的升高。而用anti-miR-1 inhibitor处理HUVEC可显著减弱PAEV诱导的NF-κB活化，并且抑制miR-1可逆转PAEV诱导的KLF4抑制。综上所述，miR-1在介导脂肪变性肝细胞来源的EVs对内皮细胞的促炎作用中起重要作用。由于内皮炎症在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用，因此研究人员探索了miR-1在体内的促炎症作用。首先，通过喂养HFD构建ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化动物模型，并用antagomiR-1（由锐博生物提供）治疗小鼠以阻断miR-1的作用。结果发现小鼠主动脉组织中的炎症表型被显著减弱，证实了antagomiR-1对实验动物的疗效。此外，antagomiR-1治疗可显著减少主动脉弓、胸主动脉区和整个主动脉中动脉粥样硬化斑块的数量和大小，并且可使小鼠的病变区域明显减少。另外antagomiR-1可显著降低平滑肌肌动蛋白（SMA）水平和ICAM-1的表达，表明antagomiR-1能够抑制斑块内血管平滑肌细胞的生长，减轻动脉粥样硬化病变。这些结果表明抑制miR-1可以显著改善ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化斑块的形成和发展。原文：Jiang F, Chen Q, Wang W, et al. Hepatocyte-Derived Extracellular Vesicles Promote Endothelial Inflammation and Atherogenesis via microRNA-1[J]. Journal of Hepatology, 2019.
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