自噬是发生在所有真核细胞中的一种保守的降解过程，其功能障碍与包括癌症在内的多种疾病有关。尽管目前有大量的研究发现了包括蛋白质和miRNAs在内的自噬调控新分子，但对于长链非编码RNAs（lncRNAs）在该调控过程中的功能却知之甚少。
为了鉴定自噬过程中新的功能性lncRNAs，研究人员针对600多个lncRNAs转录本进行了高通量RNAi筛选，并监测其对MCF-7细胞自噬的影响。鉴定并揭示了lncRNA DRAIC在调节自噬潮中的新作用。并且发现DRAIC的促增殖作用与自噬无关。为lncRNA和自噬领域的研究提供了宝贵的资源，促进了目前对非编码RNAs自噬调控的理解。
🔵 基于siRNA的高通量筛选鉴定影响自噬的lncRNAs
为了鉴定参与自噬调节的lncRNAs，研究人员在自噬体标记物GFP-LC3B稳定表达的MCF-7乳腺癌细胞中进行了基于siRNA的高通量筛选，并且通过荧光显微镜定量分析GFP-LC3B斑点形成，作为自噬特异性依据。
首先，研究人员针对肺癌、肝癌或乳腺癌中638个上调的lncRNAs制备siRNA文库，转染细胞后，通过高内涵成像和自动化定量分析，鉴定了63个lncRNAs转录本在敲低后会影响GFP-LC3B斑点的数量，暗示可能参与自噬的调控。然后根据基因注释、外显子-内含子结构和基因组位置，研究人员选取14个候选lncRNAs（6个下调，8个上调）进行验证筛选，发现转录本uc002asg.1（lncRNA DRAIC）的敲低最显著地减少了GFP-LC3B斑点阳性细胞数量。
通过数据库分析和核质分离证实DRAIC在MCF-7细胞中是细胞质和细胞核定位，并且Torin1处理诱导的自噬不会改变DRAIC的细胞定位。此外，研究发现DRAIC在乳腺癌中高表达，而自噬并不影响其表达水平，表明DRAIC是自噬非依赖性的。
🔵 DRAIC敲低减少了自噬体数量和LC3B蛋白水平
研究人员通过透射电子显微镜法观察和量化了DRAIC敲低后成熟自噬体的数目，结果发现自噬体超微结构没有明显变化，但自噬体的数量更少。GFP-LC3B斑点和自噬体的减少是否与较低水平的LC3B蛋白相关呢？Western blot结果显示，DRAIC敲低使得GFP融合和内源性LC3B (I和II)的表达均降低，但LC3B和GFP-LC3B mRNA水平保持稳定。过表达DRAIC则明显增加了LC3B蛋白水平。
🔵 DRAIC敲低增加了自噬潮并作用于mTOR途径
由于自噬是一个动态的过程，自噬体数量的减少和LC3B蛋白水平的降低可以说明两种不同的情况。要么自噬诱导减少，表现为PE结合的LC3B (LC3B-II)较少，要么自噬潮增加，以至于大部分LC3B-II被溶酶体降解。研究人员发现DRAIC的缺失降低了自噬受体p62的蛋白水平，而p62是一种自噬货物，它被掺入自噬体并在自噬体中降解。因此，DRAIC敲低后导致的p62减少表明了自噬潮的增加。
为了进一步研究DRAIC对自噬潮的影响，研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建了ATG5和ATG7敲除的MCF-7细胞，发现在这些敲除细胞系中敲低DRAIC对LC3B-I的作用已基本消除，这表明DRAIC介导的LC3B调控需要ATG5和ATG7依赖性自噬潮。
由于mTORC1复合物是自噬途径的关键上游调节因子之一，那么DRAIC是否也会影响mTORC1信号传导呢。实验发现DRAIC缺失会导致mTOR激酶的直接靶点ULK1的Ser757磷酸化减少以及p70S6激酶的Thr389磷酸化水平明显下降。
总之，这些结果表明在缺乏DRAIC的情况下，mTORC1下游的信号传导减少，自噬潮增加。
研究人员除了对GFP-LC3B斑点进行定量分析外，还对每个siRNA转染过程中的细胞活力进行了测量，发现DRAIC的敲低会导致细胞计数下降。为了了解DRAIC对细胞活力的影响及其与自噬表型的可能联系，研究人员对DRAIC缺失的MCF-7细胞进行了RNA测序。基因集富集分析发现在DRAIC敲低后下调的基因中，E2F靶基因和G2M检查点基因富集比例最高
流式分析显示DRAIC缺失的细胞在G1期(76.8和83.2%)积累，S期检测到的细胞较少。
通过western blotting进一步分析DRAIC对细胞周期调节因子的影响，发现DRAIC敲低导致p53及其下游靶点p21上调，导致细胞周期蛋白A、E2和D1减少，并且降低了Rb在S608和S795位点的磷酸化。表明DRAIC与细胞周期从G1期向S期过渡有关。
🔵 DRAIC以自噬非依赖性方式对细胞增殖至关重要
研究发现DRAIC的缺失导致细胞增殖率下降，而过表达DRAIC导致细胞增殖速度加快，证实了DRAIC与增殖有关。为了进一步探索增殖缺陷是否与自噬有关，研究人员将ATG5和ATG7敲除细胞系中的DRAIC的敲低，并监测其生长，结果发现自噬缺陷细胞也表现出同样的增殖缺陷。表明DRAIC以自噬非依赖性方式对细胞增殖至关重要。
总之，目前的高通量高内涵siRNA文库筛选为研究lncRNAs在自噬中的功能提供了有价值的资源。在此基础上，本研究鉴定了lncRNA DRAIC是乳腺癌细胞自噬的一种新的调节因子。深入了解了lncRNAs与自噬之间的相互依赖关系，可能在不久的将来就可以推动临床治疗的发展。
原文：Tiessen I, Abildgaard M H, Lubas M, et al. A high-throughput screen identifies the long non-coding RNA DRAIC as a regulator of autophagy[J]. Oncogene, 2019, 38(26): 5127-5141.
锐博生物高内涵细胞成像与筛选服务-siRNA文库筛选是在锐博生物拥有的亚洲领先的激光共聚焦高内涵平台IN Cell 6500HS平台上，结合预制或定制型siRNA文库，针对细胞不同阶段出现的信号或行为，快速准确筛选出科学家课题项目中可能感兴趣的功能基因、疾病致病因子、全新靶点、药物靶标等，锐博生物提供基于高内涵细胞表型分析与大数组宏分析的技术服务，帮助科学家们精准捕获大量样本siRNA沉默后的高清显微图像、多样化多通道的筛选或分析结果。2020年即日起至3月31日，凡是委托锐博生物进行高内涵siRNA文库筛选技术服务并签订合同的，一律享受8折特价优惠，全年仅限此时。
不限样本量，不限板数或孔数，全力为您提供高质量和高性价比的高内涵技术服务。
基于siRNA的高通量筛选流程：1、siRNA 文库（pooled siRNA 形式）初筛；2、根据初筛结果挑选有效基因的siRNA（individual siRNA）进行复筛；3、根据复筛结果挑选效应最强最稳定的基因进行其它功能指标检测
服务优势：
■ 亚洲领先高内涵平台，丰富项目经验和方法学策略：数千例样本的项目经验，上百种方法学开发，满足更多需求
■ 高通量自动化：多样本、多参数、自动移液/洗板/CO2培养/分液/控制，避免人为主观干预影响
■ 多检测通道，结果呈现更丰富，更多样化： ACUMEN eX3覆盖405/488/633，IN Cell Analyzer 6500HS覆盖405/488/561/642
■ 强大图像捕获能力，检测灵敏度更高：宽场扫描、激光共聚焦、3D 成像、活细胞动态成像、无缝拼接图像
■ 从精准的静态分析、实时分析到快速筛选：在各种模式和条件下。获得决策计算时所需所有数据并在线分析
本文系作者 @锐博生物 授权发布在 肽度TIMEDOO。未经许可，禁止转载。
