麻省理工学院：利用CRISPR实现病毒高通量检测，一次检测169种病毒

研究人员已经开发出一种新技术，可以灵活地扩展基于CRISPR的分子诊断学，使用微流控芯片可以同时运行数千种测试。单片芯片的能力范围可以从一次在1000多个样本中检测一种单一类型的病毒，到在少量样本中搜索160多种不同的病毒，包括COVID-19病毒。

这项技术被称为核酸多重评估的组合排列反应(Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids，CARMEN)，研究人员在病人样本上进行了验证，当天就能得到结果，将来有望应用于广泛的公共卫生工作。

这项研究成果发表在《自然》（Nature）杂志上，由麻省理工学院Broad研究所和哈佛大学博士后Cheri Ackerman和Cameron Myhrvold共同领导。Broad研究所核心成员、麻省理工学院生物工程系副教授Paul Blainey和哈佛大学教授、Broad研究所成员以及霍华德·休斯医学研究所研究员Pardis Sabeti是这篇文章的共同通讯作者。

Sabeti说：”当前的大流行强调了快速且灵敏的工具对于诊断、监测和确定人群中的感染的重要性。我们迫切需要可以广泛应用于社区的创新型诊断方法。”

“基于CRISPR的诊断是一款颇具吸引力的工具，因为它们具有可编程性、敏感性和易用性，”Myhrvold说。”现在扩展诊断工具的能力，我们可以发掘综合方法的潜力，例如使临床医生能够确定患者是否感染多种病毒，快速找出感染源，同时对大量严重感染的患者进行测试。”

小型化CRISPR诊断

为了建立一款具有上述能力的测试平台，研究团队转向微流控技术，他们对Blainey实验室2018年开发的技术进行了调整和改进。研究人员创造了一个比手机稍微大一些的塑料芯片，上面含有数千个微孔并粘附在玻璃片上，每个微孔可以装载一对纳升级别的液滴。其中一个液滴含有样本中的病毒遗传物质，另一个液滴含有病毒检测试剂。

芯片使用的检测方法改编自基于CRISPR的诊断测试SHERLOCK，一项由Broad研究所、麻省理工学院麦戈文脑研究所、麻省理工学院医学工程与科学研究所和哈佛大学生物工程研究所的科学家们于2017年开发的技术。

为了使用CARMEN平台，研究人员首先从样本中提取病毒RNA并进行复制，这个过程类似于目前用于疑似COVID-19病例的RT-qPCR诊断法的准备过程。然后，研究人员在每个准备好的样品中加入一种独特的荧光色染料，并将混合物分成小液滴。

另一方面，检测混合物中含有CRISPR蛋白Cas13，这是一种寻找特定病毒序列的引导RNA，以及报告结果的分子。这些混合物也有颜色编码，也被分离成液滴。

成千上万的液滴从样品和检测混合物中汇集在一起，并通过一个单一的管道加载到芯片上。芯片中的每个微孔能捕获两对液滴。当探测液滴在同一微环境的样品液滴中找到它的目标，一种特定的病毒遗传序列时，荧光显微镜就会产生并检测到一个信号。整个过程，从RNA提取到结果，用时不超过8小时。

麻省理工学院Broad传染病和微生物组项目的研究生Gowtham Thakku表示：”将这两种技术结合在一个单一的平台上，为我们研究临床和流行病学问题提供了令人兴奋的新能力。”

CARMEN使单片微流控芯片上的4500多个测试成为可能，该芯片可以使用现有的荧光编码，以多种方式应用于患者样本。例如，一个芯片可以同时测试一个病毒的1048个样本，或者测试169个病毒的5个样本。通过添加更多的芯片，可以很容易地进一步扩大容量，通常在一天内可以运行四五个芯片。

多重功能

为了展示该平台的多诊断能力，该团队制定了一项策略，对数十个样本进行快速检测，检测169种与人类相关的病毒，这些病毒有10多个已公布的基因组序列。研究人员使用多种芯片对58名患者的样本进行了检测。他们还将CARMEN应用于患者样本，以区分A型流感毒株的亚型和检测艾滋病毒的耐药性突变。

该团队还将SARS-CoV-2和其他呼吸道病原体的检测混合物纳入其中，以演示如何使用合成的病毒序列来快速检测新出现的病毒。

研究人员报告称，CARMEN在诊断测试中提供了令人印象深刻的通量和灵活性，该平台的灵敏度与之前发表的SHERLOCK测试相当，他们还在继续改进和利用更多的临床样本对CARMEN进行验证。根据该团队的说法，辅以研究论文中描述的来自患者样本的成功测试数据，这种方法在临床中很容易转化。

Blainey说：”这种小型化的诊断方法资源效率高，易于实现。新工具需要创造力和创新，随着化学和微流体技术的进步，我们对CARMEN的潜力充满热情，因为全民都在努力击退COVID-19和未来的传染病威胁。”

来源：MEMS