国际首次：李华伟/舒易来团队通过CRISPR基因编辑，预防获得性感音神经性聋-肽度TIMEDOO全球超过13亿人患有后天性听力下降，感音神经性聋（sensorineural hearing loss，SNHL）最多见，致聋原因主要包括噪音、耳毒性药物、衰老、遗传、感染等因素，目前尚无可治疗的药物（突发性耳聋除外）。氨基糖甙类抗生素（aminoglycosides，AGs）所致耳毒性聋是获得性SNHL的主要类型之一。
对于需要多疗程静脉用药的患者（例如，结核病和囊性纤维化病患者），AGs耳毒性的致病率甚至超过50%，但临床上缺乏有效的防治对策。Htra2基因编码的线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可与X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）结合发挥促进细胞凋亡的作用。李华伟/舒易来团队在前期研究中发现Htra2基因在新霉素损伤后的耳蜗中表达水平明显上升，可能参与了耳毒性聋的发病。CRISPR/Cas9基因编辑已在遗传性聋基因治疗研究领域取得了一定进展，但尚无用于防治获得性非遗传性SNHL的研究。2021年3月22日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟教授与舒易来研究员团队在Genome Biology 期刊上发表了题为：Prevention of acquired sensorineural hearing loss in mice by in vivo Htra2 gene editing 的研究论文。
该研究设计了两种针对Htra2基因的CRISPR/Cas9系统（SpCas9和SaCas9系统），通过新型腺相关病毒（AAV）Anc80L65运载进入小鼠内耳，实现在体Htra2基因有效编辑，促进耳蜗毛细胞存活，显著改善氨基糖甙类抗生素暴露后小鼠的听觉功能。
据悉，这是国际上首个基于CRISPR/Cas9基因编辑用于防治获得性非遗传性感音神经性聋成功的研究。
国际首次：李华伟/舒易来团队通过CRISPR基因编辑，预防获得性感音神经性聋-肽度TIMEDOO
该研究首先构建针对Htra2基因的SpCas9系统，设计了三个特异性的向导RNA（guide RNAs，gRNAs），在体外HEI-OC1细胞系检测三个gRNAs的切割活性，发现Sp-g1、Sp-g2和Sp-g3的体外编辑效率分别为87.27 ± 0.02%、71.72 ± 1.27%和74.88 ± 0.77%。之后在体外培养的耳蜗Corti氏器中验证Anc80L65–SpCas9体系对耳蜗毛细胞的保护作用。
AAV-Anc80L65可高效转导耳蜗内、外毛细胞，但AAV包装容量有限，很难通过单载体包装整个SpCas9系统。该研究采用split-SpCas9策略，将SpCas9分割，并用双AAV包装；通过多位点切割提高敲除效率。在体外Corti氏器新霉素损伤模型中，所构建的Anc80L65–SpCas9–Htra2-gRNA治疗体系可敲除Htra2基因，促进耳蜗毛细胞存活，有效预防了氨基糖甙类抗生素的耳毒性。
在体外新霉素损伤模型中证实了该基因编辑系统的有效性后，进一步于体内探索该系统的疗效。由于Anc80L65–SpCas9系统需要分割成双AAV，这可能会影响整个Cas9系统在毛细胞的转导效率。因此，该研究也构建了Anc80L65–SaCas9单AAV载体系统，检测其对新霉素耳毒性聋的预防作用。
研究发现，在体内新霉素损伤模型中，无论是SpCas9还是SaCas9系统，均能有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。经过AAV–SpCas9体系预处理的小鼠在新霉素损伤后2周表现出更多的毛细胞存活，尤其在耳蜗中、底圈区域。该基因治疗体系对小鼠听觉功能也有明显保护作用。听力改善最明显的小鼠在8 kHz的ABR阈值比对侧耳下降40 dB。实验观察到新霉素损伤后8周，AAV–SpCas9体系的听力保护作用仍然长期持续。
AAV–SaCas9体系同样可以促进耳蜗中、底圈毛细胞的存活并改善听力。4周龄小鼠注射耳的ABR阈值在测试的所有频率（4、8、16、24和32 kHz）均比未注射耳显著下降，平均保护阈值10–20 dB。在小鼠6周龄，保护效果仍十分明显，最好的阈值改善达到50 dB。课题组同时进行了AAV–CRISPR/SpCas9及SaCas9体系的安全性评估，在研究观察期内，未发现明显的脱靶情况，且对野生型小鼠的听力没有影响，说明该治疗体系是安全的。
该研究证明了Htra2基因是潜在的预防氨基糖甙类抗生素耳毒性的治疗靶点；还证明了以基因编辑体系对Htra2编辑可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋，为获得性聋的干预临床转化提供了科学依据。
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟教授和舒易来研究员为共同通讯作者，顾晰博士后、王大奇博士后和徐值娇助理实验师为共同第一作者。该研究的第一单位和通讯单位均为复旦大学附属眼耳鼻喉科医院。
来源：生物世界