最近几年的研究表明，染色体外环状DNA（ecDNA）可以促进癌基因扩增，驱动肿瘤进化，并具有遗传异质性，在癌症发生中发挥着关键作用[1,2,3,4]。但由于缺乏足够的分子分析技术，尽管ecDNA自1964年以来就已为人所知，对其具体作用的阐明却一直进展缓慢。目前的研究主要通过拷贝数变异（如Amplicon Architect）[5]和识别ecDNA junction位点（如Circle-Map和CIRC_finder）[6,7]等方法从测序数据中识别ecDNA。但是对ecDNA功能表观遗传学的研究还很缺乏。而了解全基因组范围ecDNA的染色质状态和转录状态是至关重要的，有助于促进对ecDNA及其在癌基因表达中的作用的深层认识。用传统的ATAC-Seq和Chip-Seq等方法进行ecDNA研究时需要将DNA打断，进行短片段测序，配合的计算方法大部分是通过检测junction位点来识别ecDNA，所以只能揭示邻近junction区域的染色质可及性和DNA结合蛋白修饰，而不能提供完整的ecDNA染色质状态以及中远端调控元件之间的关系。另外，传统方法的数据分析基于peak calling策略，无法提供单分子级的ecDNA结构和表观遗传信息，所以也无法获得不同状态下ecDNA分子的表观异质性。近两年，基于单分子长读长测序方法开发的nanoNOMe-seq[8]、SMAC-seq[9]和Fiber-seq[10]技术，可以同时获得单个DNA分子的碱基信息和甲基化信息，已经在单分子表观遗传异质性与调控元件远端互作方面取得了应用，但在ecDNA领域还未见报道。
新技术！ecDNA与线性DNA的表观遗传差异研究迎来重要进展-肽度TIMEDOO
基于上述，华大基因唐冲博士团队于近日在表观遗传与染色质研究权威期刊Epigenetics & Chromatin上发表题为”Sequencing of methylase-accessible regions in integral circular extrachromosomal DNA reveals differences in chromatin structure”的论文（点击页面左下方“阅读原文”可查看），开发出一种单分子层级研究ecDNA染色质开放性的新技术 —— CCDA-seq。
01研究成果
该研究利用m6A MTase甲基转移酶对基因组DNA进行处理，获得单分子水平的染色质开放性区域的m6A DNA甲基化修饰（(图1A)。为了提高ecDNA捕获效率，该方法还引入外切酶去除线性基因组DNA并通过纳米孔测序对完整的ecDNA进行测序。对生成的数据，首先通过junction序列识别ecDNA分子，并动态地将序列片段映射到基因组中（图1B）。基于junction的位置，重新组装部分ecDNA序列作为新的参考，并根据重组后的ecDNA序列识别出m6A信号，以防止juction区域的信号产生偏差，并且重构了完整的ecDNA（图1B）。
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图1 流程概况A. 左为ATAC-seq+ecDNA，右为CCDA-seq+ecDNA；B. 生信分析流程
为了提高m6A甲基化判读的准确性，该方法增加了阴性样本进行m6A甲基化的识别，通过高斯混合模型对calling的概率值分布进行拟合，去除了背景噪声（图2）。并且通过与DNase-seq进行比较，CCDA-seq与DNase-seq数据在高表达基因的转录起始位点周围显示了相似的核小体模式，在不同分辨率的基因组尺度上也具有高度的一致性（图3、图4）。测序reads长度在10到100 kb之间，比传统ATAC-seq中观察到的Junction区域宽50倍（图5）。
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图2 经处理和未处理样品的m6A甲基化概率分布A. 阴性样本；B. 甲基转移酶标记样本
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图3 高表达基因在转录起始位点周围的染色质可及性
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图4 CCDA-seq信号与DNase-seq染色质可达性信号在基因组上的分布
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图5 ONT reads长度分布
进一步，通过比较ecDNA和同源线性DNA的平均染色质可及性，发现ecDNA染色质的可及性大部分是高度开放的，并且比线性DNA的染色质可及性更高，强化了ecDNA扩增会导致更高的致癌基因转录的普遍观点。（图6）RNA-seq数据分析显示，ecDNA高表达基因340个（25% rank），中表达基因464个（25-75% rank），低表达基因589个(75%-100% rank)，说明并不是所有的ecDNA基因都是高表达的（图7）。通过分析转录起始/终止位点的附近的染色质可及性信号，CCDA-seq准确定位到NDR(nucleosome depletion regions)（图8）。
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图6 ecDNA和线性DNA中的甲基化率密度分布
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图7 ecDNA和线性DNA上基因区域的平均甲基化率
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图8 转录起始位点与转录终止位点上下游ecDNA与线性DNA的信号值分布
为了进一步探索ecDNA的功能，该方法对ecDNA单分子数据进行组装，重构出完整ecDNA，并且ecDNA上携带完整的致癌基因。如TSG101 (Tumor Susceptibility Gene 101.)， 对ecDNA上的基因进行Gene Ontology分析显示富集到与癌症显著相关的通路，如GTPase activator activity。
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图9 完整的ecDNA
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图10 ecDNA相关基因的gene ontology分析
CCDA-seq 提供了单分子分辨率下数千碱基长度的染色质状态，通过比较ecDNA和线性基因组DNA中的单分子水平的染色质信号分布，观察到线性DNA和ecDNA中的多种染色质可及性状态，线性DNA (chr10: 4238321 – 42389251)的染色质结构采用两种不同的构象:一种是核小体不活动状态，另一种是由于极高的转录活性而基本缺乏核小体的状态，而ecDNA中观察到具有高度异质性的核小体耗尽/占据模式，在bulk ATAC-seq中则无法获得不同状态下分子的表观异质性（图11）。接下来，通过评估核小体定位相关性研究了ecDNA和线性基因组DNA的共可及性模式，与线性DNA相比，ecDNA中的核小体具有更高的相关性，并且ecDNA中的作用距离更远，表现出远程染色质相互作用（图12）。
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图11 线性DNA与ecDNA单分子水平的染色质信号分布A. 如图所示是覆盖线性DNA区域chr10: 4238321 – 42389201的所有reads。方框突出显示了活性和非活性染色质；B. 显示的是覆盖ecDNA区域chr10: 42383201 – 42389201的所有reads
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图12 线性DNA与ecDNA的染色质共可及性概况（chr16:46407201 – 46410201）
02总结
总体来说，利用CCDA-seq，观察到了开放染色质区域中ecDNA的多样性，在数千碱基长度尺度上定位到了核小体的分布，以及量化了单分子分辨率下远端调控元件的染色质状态的相关性，揭示了单分子水平线性DNA与ecDNA不同的染色质状态。CCDA-seq有助于更全面地了解ecDNA表观基因组的调控，为ecDNA调控的独特机制提供深入的见解。
参考文献：[1] Wu S, Turner KM, Nguyen N, Raviram R, Erb M, Santini J, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575(7784):699-703.[2] Turner KM, Deshpande V, Beyter D, Koga T, Rusert J, Lee C, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543(7643):122-5.

[3] Paulsen T, Kumar P, Koseoglu MM, Dutta A. Discoveries of Extrachromosomal Circles of DNA in Normal and Tumor Cells. Trends Genet. 2018;34(4):270-8.

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[5] Deshpande V, Luebeck J, Nguyen N-PD, Bakhtiari M, Turner KM, Schwab R, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nature communications. 2019;10(1):1-14 %@ 2041-1723.

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