微生物数量巨大、种类繁多，被称为人体第二套基因组，既往研究结果发现微生物与多种疾病相关。不同的微生物具有其特异性，随着微生物的特性及其与人类健康的关系被逐步探索明确，微生物的临床应用也被陆续开发。第一代微生物应用是益生菌作为膳食补充剂的开发，这一类产品并没有预防或者治疗疾病的能力。第二代微生物应用把某些具有潜在疗效的微生物开发为药物。早在1958年，国外就有通过粪菌移植（FMT）治愈肠炎的案例，而FMT近年来也被研究用于治疗其他疾病，如肝性脑病、难治性移植物抗宿主病、慢性功能性便秘、肠易激综合征等。此外，某些微生物本身的溶瘤以及免疫激活作用，也可以开发用作肿瘤生长抑制剂或免疫刺激剂。然而，FMT治疗不具有靶向性，其对于疾病治疗的作用机制不明确，且粪便中的病毒和杂质较多，使得FMT治疗效果良莠不齐；另一方面，微生物自身特异性也往往伴随着一定的局限性，比如专性厌氧菌（如双歧杆菌）虽然能成功靶向肿瘤，却不具备直接溶瘤能力；兼性厌氧致病菌（如鼠伤寒沙门氏菌、梭状芽孢杆菌）则天然毒性过强。这些微生物的天然特性限制了它们作为生物活体药的开发和推广。随着合成生物学的发展，研究人员想到用合成生物学的手段来对微生物进行改造，以进一步平衡活菌疗法的有效性和安全性。作为一门以理性设计生物行为为目标的学科，合成生物学利用细菌作为模块化的工程平台，将基因和启动子元件合理设计组合，创造出微妙而复杂的基因线路，从而能够更精确地控制细菌的生理行为，加强对细菌的生物安全控制，调控细菌表达治疗分子的释放，增强细菌对疾病的治疗能力[1]。这种通过设计编辑工具以及反馈回路构建的具有诊断疾病或者靶向治疗疾病的工程菌株也被称为“改造菌”。在诊断方面，微生物可以发挥它快速增殖的特点，将检测到的信号无限放大，以提升疾病检测的敏感度；在治疗方面，有两条实施路径：1）体内改造，通过基因编辑选择性地靶向并沉默/杀死细菌（如Eligo公司）
2）体外改造，利用细菌作为载体把药物运输到特定位置以达到治疗目的（如Synlogic公司）
改造菌的应用广泛，本文将重点讨论把微生物体外改造作为活体生物药 (Live biotherapeutic products, LBPs) 的应用。
（工程菌内基因回路由感应元件、基因元件以及报告元件三部分组成。在接受到体外信号后，通过体内基因回路计算操控工程菌的行为，表达报告因子作为诊断，治疗因子用以治疗，毒性因子用以杀死病原菌）香港大学黄建东教授团队研究发现基因编程改造的沙门氏菌YB1不仅可以作为载体递送药物攻击实体瘤，而且可以通过激活体内NK细胞，诱导其分泌IFN-γ，在多个小鼠模型中抑制癌症转移[3]。韩国全南国立大学证实一种减毒的沙门氏菌菌株能够在肿瘤中定植，并可以过量表达鞭毛蛋白B，诱导强大的免疫反应[4]。美国加州大学研究人员通过删除E.coli的精氨酸抑制基因 (ArgR)，整合不受负反馈调节抑制的ArgA fbr突变，改造出一种工程益生菌——L-Arg细菌，这种改造菌能够特异性地定植于肿瘤，将肿瘤中积累的代谢废物“氨”转化为L-精氨酸，从而促进T细胞抗肿瘤免疫应答。另外，L-Arg细菌与PD-L1靶向抗体联合治疗提升了30%的治疗效果，74%接受联合疗法的小鼠的肿瘤都完全消退了，而在它们再次接种MC38 细胞，肿瘤并没有重新生长，这说明小鼠已经形成长效免疫了[5]。经过人工改造的工程菌作为一种有效的活体生物药，能够靶向递送药物分子，到达某些口服、肠外药物难以到达的地方（如结肠、实体瘤内部）并定植，不但避免了某些半衰期短的药物在到达作用部位前就已经被降解的问题，而且降低了全身暴露，提高了安全性。此外，改造菌不仅能实现药物靶向精准递送，还能实现药物的特异性表达、降低细胞天然毒力、增强侵蚀性和定植能力、避免细菌逃逸，同时提高了LBP治疗的有效性和安全性。此外，也有专家认为相较于以AAV（腺相关病毒）等为载体的基因治疗产品，细菌载体基因治疗产品在药物价格等方面也有潜在优势。这些特殊优势使得改造菌在调节代谢平衡、免疫调节、肿瘤抑制等方面都能发挥精准治疗的作用，为疾病的治疗方案的开发提供了更大的发展空间。1）调节代谢平衡代谢物通过血流和肠腔之间的上皮屏障运输。改造菌可以感知肠道微环境中的环境信号，并释放某些人体缺失的酶，帮助维持特定代谢物的健康水平。苯丙酮尿症（phenylketonuria, PKU）是一种由于无法代谢苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）而使其积累引起神经毒性的基因缺陷疾病。表达Phe降解酶的基因能够通过基因编辑手段被整合到益生菌中，调控两种Phe降解酶的编导，从而调节血液中Phe的代谢。此外，前面提到的经过改造的L-Arg细菌也可以用于治疗另一种代谢疾病——高氨血症。2）免疫调节毒素、微生物等可以通过肠道中泄漏的上皮屏障进入血流，这一通道导致免疫细胞的聚集，从而诱发炎症。改造菌可以感知肠道微环境和炎症特异性代谢产物以诊断炎症反应，也可以被设计产生抑制免疫系统炎症反应的细胞因子[6]。Cyanovirin-N (CV-N) 是一种独特的氨基酸蛋白，研究证实 CV-N在低纳摩尔浓度下可以干扰病毒（如HIV-1和 HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒等）与靶细胞受体间相互作用，链球菌可以被改造成为一种递送CV-N并局部靶向给药的载体[7]。HIV-gp41-溶血素A是一种可以阻断 HIV 与靶细胞融合并进入靶细胞以发挥抗HIV作用的杂合肽，E.coli可以作为载体递送HIV-gp41-溶血素A[8]。3）肿瘤抑制恶性实体肿瘤生长发育的营养来源依赖复杂的脉管网络。在实体瘤内复杂的脉管分布中，由于血管走行扭曲，血液流通不畅，形成了中心厌氧区，导致大部分药物分子很难深入实体瘤内部，因此药物分子对实体瘤的治疗效果大打折扣。这也是导致CAR-T疗法在白血病等血液肿瘤中有不错的治疗效果但在实体瘤中却反馈不佳的原因。然而，氧气浓度恰恰成为了大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等兼性或专性厌氧菌感知和靶向肿瘤微环境的灯塔，它为这类细菌的靶向定植提供了指引，使其更好地定植于肿瘤。除了某些细菌本身具有溶瘤作用，利用部分厌氧菌趋向于低氧环境的特性，我们可以把微生物作为载体将药物深度递送进肿瘤内，重新激活或者促进免疫应答，如前文提及的改造E.coli的例子。目前已经报道的细菌递送药物分子，包括Cly-A、DT-A、TRAIL等细胞毒性药剂，或者IL-2、IL-18、CCL21等细胞因子，或者p53等调控因子，或者Stat3等小分子干扰RNA等[9]。此外，改造菌也可以通过诱导低水平的炎症，来促进免疫检查点抑制剂更有效地发挥抗癌疗效。改造菌作为LBP有其独特的优势，同时也有一定的局限性，如改造菌递送药物无法到达通常无菌的区域（如大脑、骨骼等）。此外，改造菌在实际开发应用过程中也面临着重重挑战。合成生物学是一门多学科高度融合、精妙且高效的工具，它对使用者的要求较高，基因编辑技术的成熟度很大程度影响了改造菌的有效性和稳定性。目前常用的改造手段包括CRISPR/Cas 9和同源重组。被称为“基因魔剪”的Crispr/Cas 9能够对小片段基因进行剪切、沉默和失活等改造操作，可扩展空间更广；而同源重组作为一种成熟的基因改造技术，使用起来更加直接简单，也有专家认为它的改造效率更高。开发工程治疗菌的限制不仅在于对合成生物学工具的应用，更多在于对疾病病理的了解以及对LBP治疗疾背后机理的深入探索，才能更好地平衡改造菌的有效性和安全性。在选择适应症时，也应该考虑是否有更简单合适的治疗方式，才能更好地满足临床的需求。不同的微生物具有不同的天然特征，包括区域偏好、定植时间、代谢途径和调节途径等，这也使它们成为特定应用的最佳宿主，底盘菌种的选择应该取决于宿主体内的靶点和预期宿主反应。目前常被用于实验改造的模式菌（如乳酸乳球菌、大肠杆菌）多为非厌氧菌，而实际能够经过肠道发挥作用的多为厌氧菌，但厌氧菌的提取、培养、改造、运输是比较困难的，针对非模式菌的改造，还有很多未知内容需要探索。最近，MIT科学家开发出一种用来保护厌氧菌的新型自组装细胞涂层，这种细胞涂层能够使厌氧菌在加工制造时不被破坏，这也将成为微生物疗法开发的一剂催化剂[10]。实现有效性和安全性的平衡是改造菌开发的重要瓶颈。早在2019年，改造菌赛道领跑者Synlogic公司曾在Nature子刊上报导了用于治疗高氨血症的SYNB1020管线在52个健康人Ⅰ期临床试验取得的良好结果，但是后续在23个病人的1b/2a期临床研究却发现“没有证据表明SYNB1020 可以降低血氨”，这一菌株的开发也就停止了。在实际改造中，如何确保改造菌能够到达特定位置实现靶向给药、如何增强菌株的定植能力以减少重复给药、如何利用微生物的特性和基因编辑手段实现药物的特异性表达，这些都是影响改造菌有效应用的问题。安全性方面，不仅要确保改造菌的功能稳定性，避免突变和功能丢失，还要防止细菌逃逸，避免细菌传播给密切接触者或者环境。此外，改造菌和人体的复杂交互作用也是值得探索的。截至目前，美国FDA尚未批准任何一种LBP上市。除了有效性、安全性需要经过临床验证，从临床应用的角度还需考虑具体的给药方案，以达到最稳定、安全的给药效果，从LBP开发的监管角度还需考虑稳定性、批次间一致性。通过建立模型、菌株优化及体外体内实验筛选得到的候选菌株，需要考虑下游大规模生产的因素，如发酵过程中的细胞活性、pH、温度及给药途径、剂量、以及针对不同患者的特定治疗方案等等。目前全球范围内已有不少玩家进入改造菌赛道，多数瞄准在遗传代谢病、炎症性疾病、实体瘤等适应症。少数公司也布局了脑-肠轴相关的改造菌管线，但是从最近Cell期刊发表的对于肠道菌群与自闭症的因果关系的颠覆性文章来看[12]，这个方向还是有一定的不确定性。在改造菌赛道出发得比较早的是美国的Synlogic公司，2017年已经在纳斯达克上市，现有管线产品主要针对代谢、免疫两类适应症，治疗PKU的两款产品（SYNB1618、SYNB1934）已经进入临床Ⅱ期，其中SYNB1618曾获FDA授予的孤儿药称号，最近发布的II 期研究中期分析中SYNB1618也显示出在多个剂量水平、多个时间点上降低Phe的临床意义。此外，Synlogic最近还宣布与 Ginkgo 合作研发用于治疗高胱氨酸尿症（HCU）药物 SYNB1353。国内包括和度生物、Delonix（羽冠生物）、港药溶瘤在内几家企业也在该赛道中崭露头角。和度生物在2021年10月份完成了Pre-A轮融资，目前的管线瞄准在肿瘤免疫、自身免疫和代谢疾病；Delonix是2020年创立的企业，在2021年3月份完成了1400万美元的种子轮融资，管线产品也独树一帜，开发合成疫苗和活菌药物；港药溶瘤是2021年成立的公司，重点关注溶瘤细菌的产品开发，核心产品YB1即将进入临床试验阶段。合成生物学技术的逐渐成熟赋予了微生物疗法新的能量，改造菌的靶向精准给药、特异性表达药物等特殊优势也充分展现出了巨大的临床应用潜力。然而要塑造足够聪明的改造菌也并非易事，到底哪一个改造菌“战队”能够率先走上临床应用的战场，让我们拭目以待。[1] 刘陈立,等.集成技术,2021,10(04):78-92.[2] 祝洁,等.生物工程学报,2019,35(12):2350-2366.[3] Lin Q, et al. Nat Commun. 2021;12(1):2537.
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[9] 董宇轩,“科学大院”公众号
[10] Fan G, et al. J Am Chem Soc. 2021;10.1021/jacs.1c09018.
[11] Charbonneau MR, et al. Nat Commun. 2020;11(1):1738.
[12] Yap CX, et al. Cell. 2021;184(24):5916-5931.e17.
来源：蓝色彩虹
蓝色彩虹是由华大发起，服务于全球生命科学初创公司的孵化与创投平台。关注生命科学领域在DNA、RNA、蛋白、细胞、组织等多组学尺度上的前沿研究与技术，致力营造全要素支持的创新生态，提升产业转化效能。下设奇迹之光创业投资基金，专注于生命科学产业链具有极高增长潜力的早期项目投资。2015年成立至今，帮助了数十家生命科学初创项目在创业早期快速成长，累计项目估值超百亿，培养超过150个生命健康领域的高端复合创新创业人才。
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