蛋白功能的发挥需要其在不同构象之间进行转变。虽然目前结构生物学对蛋白结构的解析已经能够达到原子分辨率，但所获得的蛋白结构仍主要以占比较高的低能态为主。蛋白在功能发挥的过程中存在一些瞬时的、高自由能的亚态，获取关于这些亚态的信息对于充分理解蛋白作用机制具有重要意义，但目前的技术手段在捕捉这些瞬时结构上仍存在局限性。2022年3月2日，布兰迪大学Dorothee Kern课题组于Nature发表题为Structure determination of high-energy state in a dynamic protein ensemble的研究论文，通过结合NMR假接触化学位移 (pseudocontact chemical shift, PCS) 和Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 弛豫弥散 (PCS-CPMG) 对蛋白瞬时的高能态进行结构解析，同时确定了蛋白在功能发挥过程中伴随构象变化而产生的动力学或热力学改变。
相比于X射线晶体学和冷冻电镜，NMR在解析蛋白高能态结构中具有一定的优势，通过核极化效应 (nuclear Overhauser effect, NOE)、残留偶极耦合 (residual dipolar coupling, RDC)、顺磁弛豫增强 (paramagnetic relaxation enhancement, PRE) 及PCS等对结构进行进一步约束，可以使所获得的结构信息更为准确1-3。但在实际应用NMR解析高能态结构时仍存在诸多困难，譬如，化学位移虽曾被用于解析小蛋白（小于150个氨基酸）的高能态结构，但在将化学位移与结构相关联时仍存在较大的不确定性4。本文所使用的方法主要依赖于PCS，能在结构解析时提供长程的约束。PCS定义为反磁化学位移与顺磁化学位移之间的差值，相比于化学位移能提供更多的三级结构以及结构域之间的信息。此外，PCS与弛豫弥散的偶联，使得弥散效应更显著且可调控。
腺苷酸激酶 (adenylate kinase, Adk) 的构象变化与其酶促反应周期密切相关，其低能态的闭合状态在晶体结构中已被解析，但高能的活化状态的存在只被间接证实。利用PCS-CPMG，研究人员发现Adk催化核心及AMP lid部分表观PCS的变化更大，提示高能态中ATP lid和AMP lid处于开放状态，且这一开口的大小实际小于此前的认知5（图1）。
图1. Adk在催化过程中的不同状态及其在顺磁和反磁对实验获得的1HNCPMG数据进行分析，发现在高能状态下，AMP lid开口大约为15°，与闭合状态更为相似。由于实验中ADP浓度为饱和状态，这一高能态的结构应当是被底物或产物完全占据的，因而这一结构较好地揭示了Adk为产物的释放做准备的过程（图2），解释了底物结合和产物释放过程中的构象选择及诱导-适应。图2. Adk高能态的结构及其在催化反应中的构象变化不同于Adk，大多数蛋白不具备顺磁金属结合的位点，为了证明PCS-CPMG这一方法在蛋白高能态结构的研究中具备一定的普适性，作者进一步在钙调蛋白 (calmodulin) 和Src激酶的模拟数据中对这一方法进行测试。对于calmodulin来说，可以采用镧系金属替代其所结合的Ca2+，而对于Src激酶来说，可以引入能够结合镧系金属的分子标签，通过这样的策略，PCS-CPMG的使用范围得到了拓展（图3）。 图3. PCS-CPMG在其他蛋白中的应用，左图为calmodulin，右图为Src激酶
综上所述，对于分子量在60 kDa以下的蛋白，且高能态占比低至该蛋白整体的0.5%时，PCS-CPMG在确定高能态的结构方面具有较大的优势。在未来，随着方法学上的进一步优化，蛋白不同构象结构的解析应当会变得更加便捷。https://doi.org/10.1038/s41586-022-04468-91.Vogeli, B., Olsson, S., Guntert, P. & Riek, R. The exact NOE as an alternative in ensemble structure determination. Biophys. J. 110, 113–126 (2016).2.Leung, H. T. et al. A rigorous and efficient method to reweight very large conformational ensembles using average experimental data and to determine their relative information content. J. Chem. Theory Comput. 12, 383–394 (2016).3. Clore, G. M. & Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chem. Rev. 109, 4108–4139 (2009).
4.Nerli, S., McShan, A. C. & Sgourakis, N. G. Chemical shift-based methods in NMR structure determination. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 106-107, 1–25 (2018).
5.Aviram, H. Y. et al. Direct observation of ultrafast large-scale dynamics of an enzyme under turnover conditions. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 3243–3248 (2018).
来源： 结构生物学高精尖创新中心
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