北京大学生命学院胡家志与合作者揭示高IgM免疫缺陷的一种分子机制

在适应性免疫系统中，由B淋巴细胞产生的多样性的抗体分子是介导体液免疫的关键性效应分子，因此，抗体分子的多样性对适应性免疫是至关重要的。机体在抗原刺激下，B淋巴细胞特异性表达的胞嘧啶脱氨酶AID能够靶向抗体分子产生程序性的DNA损伤，介导抗体类型转换（CSR）以及体细胞高频突变（SHM）的发生，从而产生具有更高亲和力的多样性抗体库。

临床发现AID蛋白的突变与免疫缺陷疾病2型高IgM综合征密切相关，并且这些突变多为隐性遗传，然而有一类C端缺失突变体AID^DC表现为显性失活效应。仍具有胞嘧啶脱氨酶活性的AID^DC由于缺少C端的出核信号而在细胞核内富集，却难以介导CSR事件的发生。那么，AID^DC在抗体基因靶点的脱氨酶活性是如何被抑制的呢，以及AID^DC又是如何影响野生型AID的功能从而导致显性失活的呢？这其中的致病机理，一直是该研究领域悬而未决的难题。

2022年4月26日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心胡家志研究员课题组与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）孟飞龙研究员课题组合作，在The EMBO Journal杂志在线发表题为“C-terminal deletion-induced condensation sequesters AID from IgH targets inimmunodeficiency”的研究论文。在这项研究中，研究人员揭示了AID^DC在细胞核内聚集进而导致AID^DC不能高效地被招募到抗体基因IgH区域；此外，该研究还引入蛋白质共凝聚的概念，巧妙地阐明了AID^DC突变体通过捕获细胞核内游离的野生型AID形成共凝聚体，从而抑制野生型AID靶向抗体基因的过程，造成显性失活效应的致病机理（Dominant-negative effect；图1）。这也是率先从凝聚体的角度来剖析显性负突变可能的致病机制。

图1. AID/AID^DC共凝聚导致免疫缺陷疾病的工作模型。在B淋巴细胞内，野生型的AID能够通过自身位于N端的入核信号而进入到细胞质内从而靶向到IgH区域，介导抗体类型转换和体细胞高频突变的发生；而当细胞内含有单个AID的C端缺失突变体AID^DC时，野生型的AID会被AID^DC与其他无膜细胞器共同形成的凝聚体捕获而进入到凝聚体内，因此难以进入到IgH区域介导后续抗体类型转换和体细胞高频突变事件的发生

研究人员通过内源蛋白标记以及CRISPR-Sirius靶向的手段，发现AID^DC在B淋巴细胞内以凝聚体的形式存在，且这种凝聚体被隔绝在IgH区域之外，失去了靶向抗体基因的能力（图2A）。为证实这种蛋白凝聚体的形成是导致AID^DC不能起始CSR的原因，研究人员将具有形成凝聚体能力的FUS蛋白偶联在野生型AID的末端，发现野生型AID蛋白也具有了形成凝聚体的能力（图2B）。与此同时，这种凝聚体的形成极大地降低了野生型AID-FUS蛋白介导的CSR事件发生频率（图2C）。这表明，蛋白凝聚体的形成是导致AID^DC不能靶向抗体基因区域并表现为免疫缺陷的原因。

图2. AID^DC形成的凝聚体与IgH区域隔绝从而抑制CSR的发生。A)通过CRISPR-Sirius靶向系统标记内源AID^DC-GFP蛋白与抗体靶向基因IgH区域的定位；B)AID-FUS-GFP及其突变体在激活的原代B淋巴细胞内的定位和分布图；C)FACS分析AID-FUS及其突变体介导的抗体类型从IgM转换为IgG1的比例

通过细胞内共表达实验，研究人员发现，AID^DC凝聚体能够特异性地捕获细胞核内游离的野生型AID进入到凝聚体内（图3A）。他们引入“optoDroplet”系统，验证了AID蛋白N端的12aa序列以及位于AID的催化活性区域的4个精氨酸序列对于AID^DC形成凝聚体十分重要（图3B）。当AID^DC或其他突变体与野生型AID蛋白共表达时，研究人员发现AID/AID^DC凝聚体能够显著降低野生型AID介导抗体类型转换的能力（图3C）。

图3. AID/AID^DC共凝聚导致显性失活效应。A)过表达AID及AID^R190X在early G1期的CH12F3细胞中荧光成像，AID与AID^R190X在核内形成共凝聚体；B)AID的N端无序序列和表面正电荷片区具有驱动蛋白凝聚的能力；C)突变驱动蛋白凝聚的N端序列或表面正电荷片区均可回补AID^R190X引发的显性失活效应

胡家志和孟飞龙为文章的共同通讯作者。北京大学生命科学学院博士后甘婷婷和中科院分子细胞科学卓越创新中心谢霞博士、饶兵博士为文章的共同第一作者；张微微、杨定鹏等亦有重要贡献。此外，该研究还得到哈佛医学院Frederick Alt院士的支持和帮助。这项研究得到北大-清华生命科学联合中心、科技部国家重大研发计划、国家自然科学基金、细胞增殖与分化教育部重点实验室以及生命科学学院仪器中心成像及流式平台的大力支持。

来源：北京大学