细胞内绝大多数的蛋白都经蛋白酶体途径降解。蛋白酶体全酶由桶状的20S核心颗粒 (core particle, CP) 和1-2个调节颗粒 (regulatory particle, RP) 共同组成1，其底部为AAA (ATPase associated with diverse cellular activities) -ATPase，对底物在蛋白酶体中的降解起调节作用2。USP14是3种蛋白酶体相关的去泛素化酶 (deubiquitinating enzyme, DUB) 之一3，能与蛋白酶体发生可逆相互作用，且在作用后被活化4，且在蛋白酶体功能的调节中发挥重要作用。在早期的研究中，由于分辨率不足、结构高度动态等原因，USP14的蛋白全长结构一直未被解析5-8，其对蛋白酶体的调节也未在原子水平被阐明。

2022年4月27日，北京大学毛有东团队在Nature上在线发表题为USP14-regulate allostery of the human proteosome by time-resolved cryo-EM的科研论文，利用深度学习强化的3D分类方法解析了USP14-蛋白酶体复合物在决定底物命运过程中一系列中间状态的结构。本文所涉及的数据处理方法在此前Journal Club中已有介绍。
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为了得到结合底物的USP14-蛋白酶体复合物，作者分别纯化了人源USP14、RPN13和26S蛋白酶体，将26S蛋白酶体与过量USP14、RPN13混合后，向体系中进一步添加Ubn-SicPY作为模式底物，在含ATP或ATPγS的情况下孵育0.5、1、5和10min，随后进行冷冻样品制备。发现在孵育1min时，整个体系中处于中间状态的复合物比例最高（图1）。进一步对该样品进行数据采集和深度学习强化的3D分类，最终得到3种EA-like (EA:泛素识别)、4种SD-like和6种ED-like (ED:进行性降解) 的中间态构象，分辨率为3.0 -3.6 Å。在所有处于ED-like状态的结构中，AAA-ATPase的孔道中均可以看到处于去折叠状态的多肽底物，而在所有处于SD-like状态的结构中，孔道内均无底物密度存在。此外，作者并未观察到处于EB (EB:去泛素化) 与EC (EC:转位起始) 两种状态的的复合物。USP14的UBL (ubiquitin-like) 结构域通过以L70为中心的疏水界面与RPN1 T2位点互作。USP14与AAA-ATPase的OB (oligonucleotide- or oligosaccharide-binding) 结构域以及AAA结构域均存在相互作用。其与OB结构域的互作主要由BL1 (blocking loop1)、BL2和BL3介导，这种互作在几乎所有的SD-like和ED-like状态中存在，USP结构域在不同蛋白酶体状态之间的摆动可能是为了适应AAA-ATPase的运动，从而维持与OB环的相互作用 (图2)。相比之下，USP14与AAA结构域的互作在不同状态下存在差异。此外，结合结构信息与生化数据，作者发现，泛素-USP-OB的互作在USP14的活化中发挥关键作用。

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图2. 蛋白酶体介导USP14的活化
Nature | 利用深度学习强化的3D分类阐明USP14对蛋白酶体功能的动态调节-肽度TIMEDOO是底物进行性降解过程中的一种中间状态，在该状态的结构中，USP14与AAA结构域存在相互作用，且AAA-ATPase RPT1亚基的两个AAA subdomain之间的Walker A motif与ADP结合。而在其他USP14不与AAA结构域互作的状态中，核苷酸结合口袋中则没有ADP或被ATP占据。结合后续生化实验，作者证实USP与AAA结构域之间的相互作用对ATPase的活性发挥变构调节作用（图3）。
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图3. USP-AAA互作界面
综合本文所得到的结构信息、动力学和生化数据，作者对USP14调节蛋白酶体活性的机制进行了进一步阐述 (图4)。USP14通过诱导蛋白酶体状态转变实现对其活性的调节，这种调节涉及到3个检查点，分别为泛素化底物的识别、底物转位起始以及泛素链的循环。在结合蛋白酶体的RPN1、RPT1亚基后，USP14活化，进而识别被蛋白酶体募集的泛素化底物。USP14的结合可能会导致蛋白酶体朝两个方向发生状态转变：1）RPN11占据底物进入OB环的入口，导致底物无法插入AAA-ATPase的通道内，USP14发挥DUB的功能，避免底物降解；2）如果RPN11缩窄但未完全封闭OB环，底物则插入AAA-ATPase的通道，进而被蛋白酶体降解。
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图4.USP14调节蛋白酶体功能的机制
综上，本文利用深度学习强化3D分类的方法，为具有高度和复杂动态性的蛋白结构的解析提供了新的思路。利用该方法，成功解析了USP14-蛋白酶体复合物工作周期中的一系列中间状态，揭示了USP14调节蛋白酶体功能和参与决定底物命运的潜在机制。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04671-8
参考文献
1. Mao, Y. In Macromolecular Protein Complexes III: Structure and Function (eds Harris J. R. &Marles-Wright, J.) Ch. 1 (Springer, 2021).2.  Dong, Y. et al. Cryo-EM structures and dynamics of substrate-engaged human 26S proteasome. Nature 565, 49–55 (2019).

3.  de Poot, S. A. H., Tian, G. & Finley, D. Meddling with fate: the proteasomal deubiquitinating enzymes. J. Mol. Biol. 429, 3525–3545 (2017).

4. Borodovsky, A. et al. A novel active site-directed probe specific for deubiquitylating enzymes reveals proteasome association of USP14. EMBO J. 20, 5187–5196 (2001).

5.  Bashore, C. et al. Ubp6 deubiquitinase controls conformational dynamics and substrate degradation of the 26S proteasome. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 712–719 (2015).

6.  Aufderheide, A. et al. Structural characterization of the interaction of Ubp6 with the 26S proteasome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 8626–8631 (2015).

7.  Huang, X., Luan, B., Wu, J. & Shi, Y. An atomic structure of the human 26S proteasome. Nat. Struct. Mol. Biol. 23, 778–785 (2016).

8. Wehmer, M. et al. Structural insights into the functional cycle of the ATPase module of the 26S proteasome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, 1305–1310 (2017).

来源：结构生物学高精尖创新中心