Nature | 利用深度学习强化的3D分类阐明USP14对蛋白酶体功能的动态调节

细胞内绝大多数的蛋白都经蛋白酶体途径降解。蛋白酶体全酶由桶状的20S核心颗粒 (core particle, CP) 和1-2个调节颗粒 (regulatory particle, RP) 共同组成¹，其底部为AAA (ATPase associated with diverse cellular activities) -ATPase，对底物在蛋白酶体中的降解起调节作用²。USP14是3种蛋白酶体相关的去泛素化酶 (deubiquitinating enzyme, DUB) 之一³，能与蛋白酶体发生可逆相互作用，且在作用后被活化⁴，且在蛋白酶体功能的调节中发挥重要作用。在早期的研究中，由于分辨率不足、结构高度动态等原因，USP14的蛋白全长结构一直未被解析^5-8，其对蛋白酶体的调节也未在原子水平被阐明。

2022年4月27日，北京大学毛有东团队在Nature上在线发表题为USP14-regulate allostery of the human proteosome by time-resolved cryo-EM的科研论文，利用深度学习强化的3D分类方法解析了USP14-蛋白酶体复合物在决定底物命运过程中一系列中间状态的结构。本文所涉及的数据处理方法在此前Journal Club中已有介绍。

Nature | 利用深度学习强化的3D分类阐明USP14对蛋白酶体功能的动态调节-肽度TIMEDOO

为了得到结合底物的USP14-蛋白酶体复合物，作者分别纯化了人源USP14、RPN13和26S蛋白酶体，将26S蛋白酶体与过量USP14、RPN13混合后，向体系中进一步添加Ub_n-Sic^PY作为模式底物，在含ATP或ATPγS的情况下孵育0.5、1、5和10min，随后进行冷冻样品制备。发现在孵育1min时，整个体系中处于中间状态的复合物比例最高（图1）。进一步对该样品进行数据采集和深度学习强化的3D分类，最终得到3种E_A-like (E_A:泛素识别)、4种S_D-like和6种E_D-like (E_D:进行性降解) 的中间态构象，分辨率为3.0 -3.6 Å。在所有处于E_D-like状态的结构中，AAA-ATPase的孔道中均可以看到处于去折叠状态的多肽底物，而在所有处于S_D-like状态的结构中，孔道内均无底物密度存在。此外，作者并未观察到处于E_B (E_B:去泛素化) 与E_C (E_C:转位起始) 两种状态的的复合物。USP14的UBL (ubiquitin-like) 结构域通过以L70为中心的疏水界面与RPN1 T2位点互作。USP14与AAA-ATPase的OB (oligonucleotide- or oligosaccharide-binding) 结构域以及AAA结构域均存在相互作用。其与OB结构域的互作主要由BL1 (blocking loop1)、BL2和BL3介导，这种互作在几乎所有的S_D-like和E_D-like状态中存在，USP结构域在不同蛋白酶体状态之间的摆动可能是为了适应AAA-ATPase的运动，从而维持与OB环的相互作用 (图2)。相比之下，USP14与AAA结构域的互作在不同状态下存在差异。此外，结合结构信息与生化数据，作者发现，泛素-USP-OB的互作在USP14的活化中发挥关键作用。

图2. 蛋白酶体介导USP14的活化

是底物进行性降解过程中的一种中间状态，在该状态的结构中，USP14与AAA结构域存在相互作用，且AAA-ATPase RPT1亚基的两个AAA subdomain之间的Walker A motif与ADP结合。而在其他USP14不与AAA结构域互作的状态中，核苷酸结合口袋中则没有ADP或被ATP占据。结合后续生化实验，作者证实USP与AAA结构域之间的相互作用对ATPase的活性发挥变构调节作用（图3）。

图3. USP-AAA互作界面

综合本文所得到的结构信息、动力学和生化数据，作者对USP14调节蛋白酶体活性的机制进行了进一步阐述 (图4)。USP14通过诱导蛋白酶体状态转变实现对其活性的调节，这种调节涉及到3个检查点，分别为泛素化底物的识别、底物转位起始以及泛素链的循环。在结合蛋白酶体的RPN1、RPT1亚基后，USP14活化，进而识别被蛋白酶体募集的泛素化底物。USP14的结合可能会导致蛋白酶体朝两个方向发生状态转变：1）RPN11占据底物进入OB环的入口，导致底物无法插入AAA-ATPase的通道内，USP14发挥DUB的功能，避免底物降解；2）如果RPN11缩窄但未完全封闭OB环，底物则插入AAA-ATPase的通道，进而被蛋白酶体降解。

图4.USP14调节蛋白酶体功能的机制

综上，本文利用深度学习强化3D分类的方法，为具有高度和复杂动态性的蛋白结构的解析提供了新的思路。利用该方法，成功解析了USP14-蛋白酶体复合物工作周期中的一系列中间状态，揭示了USP14调节蛋白酶体功能和参与决定底物命运的潜在机制。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04671-8

参考文献

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来源：结构生物学高精尖创新中心