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高血压影响着全球1/3的成年人，同时也是心血管疾病、肾脏疾病、痴呆的主要危险因素，在全球范围内带来巨大的健康和经济负担【1】。肾脏通过调节体液和电解质的稳态来控制血压，这归功于远曲小管上钠氯协同转运体NCC（sodium–chloride cotransporter），其可以回收Na+和Cl-，进而调节酸碱平衡并控制血压【2】。NCC转运活性下降会引起吉特曼氏综合症 (Gitelman syndrome), 其特征为伴有低钾血症和代谢性碱中毒的低血压【3】；而NCC转运活性上升会引起假性醛固酮减少症，其特征为伴有高钾血症和代谢性酸中毒的高血压【4】。NCC是很多肾脏及心血管疾病的首要药物治疗靶点，包括像噻嗪类利尿剂，其作为第一个具有良好疗效和安全性的口服降压药，仍然是目前首选的一线降压药【5】。尽管应用已久，但是噻嗪类利尿剂选择性抑制NCC的机制目前仍然未知。
Nature | 噻嗪类利尿剂如何抑制远曲小管回收Na+和Cl- —— 钠氯协同转运体NCC的结构解析-肽度TIMEDOO
2023年2月5日，来自美国斯坦福大学的冯亮课题组在Nature上发表了题为Structure and thiazide inhibition mechanism of the human Na–Cl cotransporter的文章。通过解析人源钠氯协同转运体（NCC）处于两种不同构象及结合噻嗪类利尿剂的结构，提出了NCC转运离子底物及噻嗪类利尿剂抑制转运的分子机制。
作者通过生化实验设计了两个可以高表达的NCC克隆，随后通过冷冻电镜解析了3.0 Å 分辨率的向内开口构象的结构，和2.8 Å 分辨率结合降压药聚噻嗪的向外开口构象的结构。在两个结构中，NCC都呈现为二聚体（图1a和图1b），每一个NCC亚基都由跨膜结构域（TMD）和胞质侧调节结构域组成（NTD和CTD）（图1c）。TMD中的TM1-TM12为APC折叠（图1d）。在胞外侧，一个cap结构域立在由TM1、TM2、TM6和TM7形成的螺旋束上（图1d）。二聚体中的CTD相互交叉并形成稳定二聚体的相互作用界面（图1b）。
Nature | 噻嗪类利尿剂如何抑制远曲小管回收Na+和Cl- —— 钠氯协同转运体NCC的结构解析-肽度TIMEDOO
图1 人源NCC的整体结构
作者还在CTD处发现了ATP（或ADP）的密度（图2a），将其相互作用的R655和L717突变则会造成转运活性的下降（图2d），说明了腺苷酸的结合对于NCC的功能起到了重要的作用。同时还在CTD的表面观察到了与NTD的相互作用界面（图2b），将其作用界面上的氨基酸做突变，可以观察到NCC的转运活性都存在着不同程度的下降（图2e），提示着NTD-CTD的相互作用对于NCC功能至关重要。NTD中T139的磷酸化对于NCC激活起到了调控作用，在结构中可以发现其位于NTD-CTD交界面中由CTD组成的带正电的区域（图2c），提示其磷酸化可能会调节NTD-CTD的相互作用并介导CTD引起的构象变化。
Nature | 噻嗪类利尿剂如何抑制远曲小管回收Na+和Cl- —— 钠氯协同转运体NCC的结构解析-肽度TIMEDOO
图2 NCC的调节结构域
作者分析结合聚噻嗪的NCC结构，发现其呈现向外开口的构象，聚噻嗪结合在由TM1、TM3、TM6、TM8和TM10组成的口袋处，并与周围的多个氨基酸相互作用，将其中的N149、F223、N227突变则会使得聚噻嗪抑制效果减弱，这与观察到的结构相吻合（图3）。
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图3 聚噻嗪结合区域
在向外开口结合聚噻嗪的NCC结构中，NCC的门腔中途穿过Na+结合位点并在底部到达Cl-结合位点，所以细胞外侧溶液中的离子都可以到达这两个位点（图4a），而在靠近细胞内侧的区域则被堵住（图4b）；在向内开口的NCC结构中，这部分则是开放的（图4c），两个离子都可以从相应的结合位点处到达细胞内侧。向内开口和向外开口的结构比对揭示了各种螺旋的移动机制（图4d），比较聚噻嗪周围的氨基酸，可以发现结合聚噻嗪的NCC如果由向外开口转向向内开口状态，聚噻嗪会和TM10的I532和F536产生位阻（图4e），揭示了聚噻嗪可以阻止NCC从向外开口转变为向内开口状态。另外，聚噻嗪结合区域与Cl-结合位点重叠，所以聚噻嗪也可以直接阻止Cl-结合。综上，聚噻嗪通过与底物离子竞争结合并阻止构象转变从而抑制NCC的功能。
Nature | 噻嗪类利尿剂如何抑制远曲小管回收Na+和Cl- —— 钠氯协同转运体NCC的结构解析-肽度TIMEDOO
图4 NCC的构象变化及聚噻嗪抑制NCC的机制
综上，本文通过解析NCC处于向内开口及结合聚噻嗪向外开口的结构，解释了噻嗪类利尿剂作用于肾脏远曲小管上钠氯协同转运蛋白NCC靶点的机制，并为优化噻嗪类药物提供了结构生物学的指导意义。同时，NCC结构中其他调节转运的结构域也为下一代药物设计提供了基础。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-023-05718-0
参考文献
参考文献
【1】Zhou, B., Perel, P., Mensah, G. A. & Ezzati, M. Global epidemiology, health burden and effective interventions for elevated blood pressure and hypertension. Nat. Rev. Cardiol. 18, 785–802 (2021).【2】Moes, A. D., van der Lubbe, N., Zietse, R., Loffing, J. & Hoorn, E. J. The sodium chloride cotransporter SLC12A3: new roles in sodium, potassium, and blood pressure regulation. Pflugers Arch. 466, 107–118 (2014).

【3】Simon, D. B. et al. Gitelman’s variant of Bartter’s syndrome, inherited hypokalaemic alkalosis, is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na–Cl cotransporter. Nat. Genet. 12, 24–30 (1996).

【4】Lalioti, M. D. et al. Wnk4 controls blood pressure and potassium homeostasis via regulation of mass and activity of the distal convoluted tubule. Nat. Genet. 38, 1124–1132 (2006).

【5】Freis, E. D., Wanko, A., Wilson, I. M. & Parrish, A. E. Treatment of essential hypertension with chlorothiazide (diuril); its use alone and combined with other antihypertensive agents. J. Am. Med. Assoc. 166, 137–140 (1958).

来源：北京生物结构前沿研究中心