革命性纳米孔诊断技术：实现无标记、无扩增病毒RNA快速检测

近日，加利福尼亚大学圣克鲁斯分校（UC Santa Cruz）和布里格姆扬大学（Brigham Young University）的研究团队领导的研究人员报告了他们开发的一种实验室芯片诊断系统。该系统将光流体学与纳米孔技术相结合，实现了对生物流体（如尿液、全血和喉拭子）中病毒RNA的无标记和无扩增量化检测。研究团队展示了该平台可在几小时内使用来自灵长类动物的样本进行SARS-CoV-2和寨卡病毒检测，其准确度相当于或甚至高于高精度PCR。

研究人员希望这项技术能成为未来快速诊断的重大创新。“这可能会成为下一个重要的诊断系统，”布里格姆扬大学电气与计算机工程教授Aaron Hawkins博士说道。“当你生病时，你去医院或医生那里，他们的测试依赖于这项技术。有可能这项技术会被安装在医院或诊所中，这样你就不必等待结果了。”

这项新技术是Hawkins、加利福尼亚大学圣克鲁斯分校电气与计算机工程杰出教授Holger Schmidt以及德克萨斯生物医学研究所（Texas Biomedical Research Institute）的Jean Patterson博士之间长期合作的结果。团队在《美国国家科学院院刊》上发表的报告标题为“利用辅助捕获的光流体纳米孔平台对灵长类生物流体中的无标记和无扩增病毒RNA进行定量”的论文中总结道：“无标记和无扩增的纳米孔测定法的多功能性、性能、简单性以及全微流控集成的潜力指向了一种独特的核酸、蛋白质和其他靶标分子诊断方法……这些设备可以用作POC诊断、协助动物模型开发的研究工具以及许多其他领域的应用。”

作者写道，近几十年来出现了多次病毒大流行，包括猪流感、埃博拉、寨卡和COVID-19，这导致了对快速、准确诊断的需求。然而，现有的廉价抗原检测试剂盒，如酶联免疫吸附试验（ELISA），虽然适用于POC使用，但在生物标志物浓度较低时敏感性和可靠性较差。PCR检测仍然是病毒学测试的准确性金标准，但该方法在多个方面存在不足。“PCR复杂，需要昂贵的试剂、中心实验室基础设施和经过良好培训的人员，因此不适用于低资源环境，”研究人员指出。有时，需要几天才能获得测试结果。

PCR反应需要对病毒DNA或RNA进行扩增，这是一种制造基因物质多个复制品的过程，可能引入和放大错误。此外，PCR测试只能检测核酸，而对于某些疾病，检测其他生物标志物（如蛋白质）可能也很有用。

Schmidt、Hawkins和Patterson及其团队现在开发了一种解决PCR相关缺陷的诊断工具。这项新技术需要很少的样本准备，无需扩增和标记——因此不使用光来识别生物标志物。团队相信，这些特点极大地简化了诊断过程的时间和复杂性。“这个潜力是巨大的，”Patterson说。“你不需要扩增就能得到准确的结果的这个想法是一个巨大的进步，与PCR问世时的重大进步相媲美。”

这种新诊断系统结合了Schmidt在光流体学领域的专长，即通过光束控制微量液体，以及用于计数单个核酸的纳米孔来读取遗传物质。该工具旨在检测寨卡病毒和SARS-CoV-2，这是美国国立卫生研究院（NIH）资助的研究的优先领域。

“我们构建了一个简单的微流体芯片系统，借助微流控、硅片和纳米孔检测技术，可以在微型水平上进行测试，”Schmidt的研究生Mohammad Julker Neyen Sampad说道，“我们的目标是简单、易用、低成本的工具开发，我相信我们已经做到了。”

要运行测试，将生物流体样品与磁性微珠混合在一个容器中。在这项研究中，研究人员使用了德克萨斯生物医学研究所的灵长类动物（SARS-CoV-2）和卷尾猴（寨卡病毒）的唾液和血液等生物流体样本。

这些微珠设计有与测试设计用于检测的疾病相匹配的RNA序列。因此，对于COVID-19检测，这些微珠上将有SARS-CoV-2 RNA链。如果样品中存在SARS-CoV-2病毒，病毒的RNA将与微珠结合。等待片刻后，研究人员将磁珠拉到容器底部并清洗其他物质。

将这些微珠放入由Hawkins小组设计和制造的硅微流体芯片中，其中它们流经一条长而细的通道，通道被一层超薄膜覆盖，Hawkins称其为“工程奇迹”的设计。这些微珠被困在一个光束中，将它们推向通道内的墙壁，通道中包含一个直径仅为20纳米的纳米孔。相比之下，人类头发约为80,000-100,000纳米宽。研究人员加热芯片，使RNA颗粒脱落并被吸入纳米孔中，纳米孔检测到病毒RNA的存在。

团队的试验表明，该测试正确检测到了PCR测试也能够检测到的每个样本的病毒，即使病毒浓度极低也是如此。还有一些情况是新测试能够检测到PCR测试无法检测到的病毒，显示研究人员的系统甚至可能比PCR更准确。“……我们发现纳米孔传感器与所有PCR阳性样本产生定性和定量一致，并且能够为多个未产生PCR结果的样本提供病毒载量读数，这可能是由于该方法的复杂性，”作者评论道。

该测试使用了六种不同的生物流体，包括唾液、血液和喉拭子，这些样品可能含有不同的病毒载量。这可以帮助研究人员更好地研究疾病如何在不同动物体内传播。“将这种光流体-纳米孔平台纳入一项包括两种致命病毒感染（即寨卡和SARS-CoV-2）和六种不同类型生物流体的纵向病毒载量监测研究中，展示了该测定法的多功能性，为无需核酸测序和扩增的临床样本固态纳米孔基分子诊断开辟了一条独特的途径，”研究人员声称。

新的微流体系统除了体积更小外，还比PCR机器复杂得多。如果将这一概念作为产品推向市场，其紧凑的尺寸可以轻松适应研究人员的实验室，从而加快病毒学测试的结果速度，提高测试的可及性，并将测试结果时间从几天缩短到几小时。“如果我们将这个系统的构建成一种仪器，研究人员可以将其放在四级生物安全实验室中，从不离开房间，你只需要放入少量样品液体，一个小时就可以完成测试，”Schmidt说道。“我认为这将有助于加快测试速度。”

在他们的报告研究中，研究人员开发了检测SARS-CoV-2和寨卡病毒的测试，但实际上它可以被设计成检测任何存在遗传样本的病毒。在未来的发展中，该团队计划进一步简化系统，并开发技术以实现多重检测，使其能够同时检测多种疾病。“在未来，该测定法的样品准备步骤可以进一步简化和微型化，”该团队写道。“此外，该方法可以通过各种策略扩展到多重分析。”Schmidt打算使用相同的策略开发用于癌症生物标志物和其他在体内留下DNA/RNA或蛋白质痕迹的健康状况的诊断工具。“总之，这项工作指引着一类高性能、低到中等复杂性的通用集成纳米孔传感器的发展方向……这些结果表明，光流体纳米孔传感器可以成为临床生物标志物诊断的独特范式，以及动物模型开发和其他应用的研究工具基础，”该团队总结道。

参考文献：https://dx.doi.org/10.1073/pnas.2400203121

编辑：周敏

排版：李丽