近年来，基因编辑领域的一些研究人员开始关注开发不受CRISPR-Cas9系统限制的工具，因为这个系统存在准确性和其他安全性方面的疑虑。
最近开发的一个工具是原位编辑系统，它是由两个组成部分组成的分子复合物：原位编辑酶和原位编辑guide RNA（pegRNA）。原位编辑酶结合了SpCas9蛋白和逆转录酶，pegRNA是经过改造的导向RNA，它识别DNA中的目标序列并编码所需的编辑。
原位编辑已经成功应用于植物、斑马鱼和小鼠的活体细胞中。然而，由于缺乏结构信息，原位编辑通过pegRNA引导的逆转录的分子机制仍然不太清楚。
现在，东京大学的研究人员利用冷冻电子显微镜确定了SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-靶向DNA复合物在多个状态下的空间结构。
东京大学生物科学系的Yutaro Shuto博士解释说：“我们发现原位编辑复合物在实验条件下不稳定，所以优化复合物保持稳定的条件是非常具有挑战性的。很长一段时间，我们只能确定Cas9的结构。”
基于这些结构的功能分析还揭示了原位编辑器如何在不切割DNA双螺旋的两条链的情况下实现逆转录。阐明这些分子机制对于设计足够准确的基因编辑工具以进行基因疗法非常重要。
研究人员成功确定了在靶向DNA上进行逆转录过程中的原位编辑复合物的三维结构的多个状态。结构显示逆转录酶结合到与DNA切割相关的Cas9蛋白的一部分，即双螺旋的单链分离。
在进行逆转录过程中，逆转录酶相对于Cas9蛋白保持其位置不变。结构和生物化学分析还表明，逆转录酶可能会导致额外的、不希望的插入。
具体来说，作者写道：“终止结构以及我们的功能分析揭示了M-MLV RT在预期位点之外延伸逆转录，导致脚手架来源的插入，从而在目标位点引起不希望的编辑。此外，对于起始、初始化和延伸状态之间的结构比较显示，M-MLV RT在逆转录过程中与SpCas9保持一致的位置，而pegRNA合成的DNA异二聚体沿着SpCas9的表面积累。”
Shuto解释说：“我们在这项研究中的结构确定策略也可以应用于由不同Cas9蛋白和逆转录酶组成的原位编辑器。我们希望利用新获得的结构信息来推动改进原位编辑器的发展。”
参考文献：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8
编辑：王洪
排版：李丽
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