lncRNA功能缺失性研究方法，你真的选对了吗？

摘要：已有定论？CRISPR、RNAi、ASO哪种更适合lncRNA研究

如何开展lncRNA研究？

LncRNAs是一类长度在200nt以上，编码蛋白能力有限的RNA分子。lncRNA基因的过表达、缺失或突变与包括癌症在内的许多人类疾病有关；然而，大多数lncRNAs的功能仍然是未知的。因此，lncRNAs的功能研究已成为科研工作者关注的重点。

CRISPR/Cas9系统为分子生物学的所有领域提供了一个革命性的基因组编辑工具。在lncRNA研究中，Cas9核酸酶可以删除lncRNA基因，或者将RNA去稳定元件引入其基因座。核酸酶缺陷型dCas9突变体保留了其RNA依赖性DNA结合活性，当与转录抑制因子或激活物结构域融合时可调节基因表达。来自德国癌症研究中心（German Cancer Research Center）Goyal A等研究人员系统地分析了CRISPR方法是否适合靶向lncRNAs。

首先，研究人员对CRISPR方法用于lncRNAs研究提出了几点疑问：

1、由于ncRNA功能的性质，CRISPRn诱变通常不适用于敲除非编码基因组基因座。

• 首先，负责执行转录本依赖性分子功能的lncRNA转录本序列通常是未确定的，这使得用Cas9对其进行诱变靶向几乎是不可能的。
• 其次，对于通过自身转录行为发挥表型的lncRNA位点，这些功能可能不会受到Cas9诱变的影响，除非Cas9靶向控制lncRNA转录的调控区域，而这对于大多数lncRNA来说都是未知的。

2、CRISPRn切除可通过删除其启动子或整个lncRNA基因来产生lncRNA敲除，但需要考虑所有潜在的基因组调控元件的位置，这显然是不太可能的。（lncRNA分类详见文末小知识）

• 对于与其他基因交叉的lncRNA来说，选择性切除全长lncRNA位点是不可能的，因为这将不可避免地改变这些基因的序列。
• 对于由内部/双向启动子产生的lncRNAs，通过删除远离其启动子并且不与任何其他基因重叠的lncRNA部分，可能产生功能性敲除。然而，lncRNA的功能结构域可能位于重叠的外显子中，而在这种情况下，lncRNA仍具有功能。
• 此外，删除部分lncRNA而不去除其TSS可能导致新基因体的产生。在任何情况下，基因组切除都可能导致调节DNA元件的缺失，这可能会影响其他基因的转录，并导致原本不属于lncRNA的表型。

3、通过同源定向敲入lncRNA基因TSS下游的转录终止信号或RNA去稳定化元件，CRISPRn HR可用Cas9敲低lncRNA。然而，CRISPRn HR策略不能用于由内部启动子产生的lncRNA，也不能用于其启动子近端区域跨越其他基因而又不干扰其序列的lncRNA。

4、CRISPRa和CRISPRi涉及将dCas9募集到靶基因的启动子近端区域，很可能影响邻近基因的表达。因此，该技术不适合用于调节由双向启动子或位于其他基因起始位点附近的启动子引起的lncRNA。并且将dCas9靶向内部启动子也可能干扰宿主基因的转录。

因此，研究人员将上述所有的位点结构进行归纳，根据对邻近基因的潜在影响，提出以下标准规则：

1. CRISPR方法不适合用于双向启动子转录的lncRNAs（正义、反义和基因间）；
2. CRISPR方法不适合用于近端启动子转录的lncRNAs（正义、反义和基因间），当lncRNA的起始点位于邻近基因起始位置接近2000bp时，称之为“近端启动子”；
3. CRISPR方法不适合用于内部启动子转录的lncRNAs（正义和反义）。

随后，全基因组分析显示大多数lncRNAs不能被CRISPR/Cas9靶向

许多lncRNAs来源于双向启动子或者与正义/反义基因的启动子/基因体重叠。根据定义的lncRNA和启动子类型对所有由Gencode注释的lncRNAs进行分类。发现基因内lncRNAs占所有lncRNAs的64％，其中40％为反义lncRNAs，而由于多个相邻基因的影响，正义lncRNAs只占13%，正反义类别占11％；基因间lncRNAs占剩余的36％。从独立的启动子和内部启动子转录而来的lncRNAs各占40%，双向转录的lncRNAs占20%。

在全基因组分析中，发现在15929个lncRNA基因位点中，只有38％的位点能够稳定（安全）地应用CRISPR，而多达62%的lncRNA基因位点存在引起邻近基因功能失调的风险，这主要是由于它们内部（35％）或双向（20％）启动子所引起的。

接着，研究人员通过各种CRISPR方法对由双向启动子转录的lncRNAs NOP14-AS1、LOC389641、MNX1-AS1或HOTAIR进行敲低实验，发现这些lncRNAs的表达显著被抑制，但同时也会影响它们各自邻近基因的表达。而基于ASO或siRNA的方法却可在不影响lncRNAs邻近基因表达的情况下敲低该lncRNAs的表达。

因此，尽管CRISPR/Cas9在双向和顺式调控表达方面具有优势，但基于ASO或siRNA的方法可能是特异性靶向复杂基因位点转录本更好的选择。

RNAi在lncRNA功能缺失性研究中已经得到了广泛而有效的应用。然而，与蛋白质编码基因不同的是，许多lncRNAs位于核内，尽管已经发现RNAi机制在细胞核中具有活性，但针对核内lncRNAs的siRNAs往往被证明效果较差。

另一种选择是反义寡核苷酸(ASOs)，其涉及RNase-H介导的靶RNA裂解。ASOs可以更高效地靶向核lncRNAs，也可以消耗新生的转录本。

针对以上问题，锐博生物独家推出Ribo^TM lncRNA Smart Silencer系列lncRNA抑制剂。对于细胞质定位、细胞核定位、细胞质和细胞核共定位以及定位不确定的lncRNA/基因，均可使用Smart Silencer进行干扰实验，在正常细胞转染效率条件下，可实现lncRNA/基因核内和胞质的全方位抑制。

Smart Silencer是由3条siRNA和3条ASO混合组成的即用型特异性lncRNA/基因抑制剂，可通过多种抑制机制获得更高的沉默效果。相比普通siRNA具有更高灵敏度和抑制效率，是进行lncRNA/基因功能缺失性研究的理想选择。

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因此，对于lncRNA功能缺失性研究更多客户倾向于选择Smart Silencer，相关研究成果更是发表在Science（IF41.058）、Science translational medicine（IF16.71）、Immunity（IF19.734）等国际顶级期刊。

1. Smart Silencer显著抑制细胞质靶标

Wang P, et al. Science, 2017, 358(6366): 1051-1055.

FISH实验证实lncRNA-ACOD1定位于细胞质，针对lncRNA-ACOD1 LOC105370268位点设计合成Smart Silencer，并转染A549细胞，结果发现lncRNA-ACOD1 RNA的表达被显著抑制。

2. Smart Silencer显著抑制核内外靶标

Meng Q, et al. Science translational medicine, 2018, 10(472): eaat6912.

核质分离显示：与细胞核lncRNA NEAT1和细胞质lncRNA OIP5-AS1相比，DGCR5是细胞核和细胞质共定位。将DGCR5 Silencer转染hNPCs细胞可显著敲低细胞核和细胞质中的DGCR5表达。

Liu J, et al. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.

核质分离与FISH实验发现lnc-Dpf3主要位于细胞质，小部分位于细胞核。将lnc-Dpf3 Silencer转染mDCs细胞可显著敲低细胞核和细胞质中的lnc-Dpf3表达，从而增加CCR7介导的mDC迁移。

3. Smart Silencer显著抑制细胞核靶标

Liu Y, et al. Cancer science, 2018, 109(7): 2188-2198.

RNA FISH实验发现NEAT1定位于细胞核，将NEAT1 silencer转染SKOV3和HO8910细胞抑制NEAT1的表达，可显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。

4. Smart Silencer显著抑制定位不确定靶标

Li H, et al. Cardiovascular research, 2018, 114(5): 747-758.

对于定位不确定的lncRNAs，将RP11-544D21.2和XLOC_014288 siRNA (smart silencer)转染HCMs细胞可分别显著敲低RP11-544D21.2和XLOC_014288的表达水平，并且RP11-544D21.2敲低减少了HUVEC的管形成和迁移。

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Smart Silencer-lncRNA/基因

Smart Silencer对照

小知识：LncRNAs分类知多少

lncRNA基因座广泛分布于整个基因组中，根据其基因组位置可分为基因间lncRNA（lincRNAs）和基因内lncRNAs。

1、基因间lncRNAs位于其他基因之间，可以由独立或双向启动子转录而来。如果在头对头（5'-to-5'）方向上相邻两个基因TSSs之间的距离≤2kb，则将基因间lncRNAs的启动子定义为双向启动子。

2、基因内lncRNAs分为正义和反义lncRNAs，这取决于lncRNAs相对于其交叉基因的转录方向。正义和反义lncRNAs又包含以下类别：

• Internal：当lncRNA嵌入另一个基因的基因体内并与其外显子重叠时；
• Intronic：当lncRNA完全位于另一个基因的内含子内时；
• Overlapping：当另一个基因完全位于lncRNA的内含子内时。

此外，如果lncRNAs与基因起始位点之间的距离≤2kb，则与其他基因在头对头方向交叉的反义lncRNAs启动子也被认为是双向的。

来源：锐博生物