【老司机的生物学课堂】染色体外DNA(下篇):肿瘤耐药的秘密武器-肽度TIMEDOO

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文|吴思涵

前篇回顾

前面的两篇有关ecDNA的文章,向大家介绍了携带着扩增原癌基因拷贝的染色体外DNA。这些小片段的ecDNA由于缺乏着丝粒,因此在细胞有丝分裂时,是随机分配到两个子代细胞中的。这样的特性,使得部分肿瘤细胞可以迅速获得大量原癌基因拷贝,并在肿瘤内部产生了高度异质性,从而驱动了肿瘤的演化与适应。这一篇文章主要向大家介绍,ecDNA会对肿瘤的治疗带来何种挑战。

一、抗肿瘤药物上调原癌ecDNA拷贝数的例子

提起肿瘤耐药,排除药代动力学的因素,最常见的机制便是肿瘤产生了新的突变,或激活了代偿生存通路,使得肿瘤细胞可以在药物的攻击下存活。但让人惊讶的是,肿瘤细胞竟然还可以通过改变基因拷贝数从而产生抗药性。这里先来为大家介绍一个经典的著名例子:化疗药甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)导致耐药肿瘤细胞的二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,DHFR)基因拷贝数升高。

MTX是一类抗肿瘤叶酸代谢药,通过与DHFR酶的底物二氢叶酸(DHF)竞争性结合,阻断了DNA的合成代谢,从而抑制肿瘤的生长。(如下图所示)

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早在上世纪四五十年代,MTX就已投入临床使用。然而这个药物却不是万能的,部分患者会在用药一段时间后产生抗性。而由于MTX的毒性较强(叶酸代谢对正常细胞也很重要),因此不能轻易加高剂量。

MTX抗性机制有几大类,一是药物进入细胞的量变少了(药物转运蛋白表达量降低),二是药物和DHFR的亲和力降低(如DHFR基因产生突变),三是DHFR整体拷贝数增加了。这里我们来谈谈第三个机制。

许多独立研究表明,在MTX耐受的肿瘤样本中,可以发现DHFR基因的拷贝数大量增加,甚至可高达几十个拷贝。这些增加的拷贝数,不光可以出现在染色体上,还能以ecDNA的形式存在。如下图的研究中,研究者发现,用MTX处理结肠癌细胞HT29,可以使其DHFR基因拷贝数增加。通过荧光原位杂交(FISH)实验发现,这些扩增的DHFR位于ecDNA。而对照组并没有发现这样的现象。

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同样的现象,通过检索文献还能发现许多,这里就不罗列了。而这样的实验结果证明,抗肿瘤药可以上调原癌基因ecDNA的拷贝。本例中,大量表达的DHFR基因克服了MTX对叶酸代谢的抑制作用,维持 DNA合成代谢活性,从而使肿瘤产生耐药性。

二、抗肿瘤药物下调原癌ecDNA数量的例子

前面的例子提到,肿瘤通过上调ecDNA数量而获得药物抗性,那有没有可能通过下调的机制来获得抗性呢?答案是有的。

2014年,我们实验室在Science上发表了一篇文章,报道了靶向药物厄洛替尼(Erlotinib,靶向EGFR蛋白激酶结构域)可以导致肿瘤细胞丢失药物靶点EGFR的ecDNA,产生抗性,并在药物撤除后重新出现EGFR的ecDNA。

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首先,我们证明了脑胶质母细胞瘤(GBM)是一个异质的群体,同时含有高表达和低表达原癌基因突变体EGFRvIII的细胞。在EGFRvIII high的细胞群体里,其PI3K/mTOR信号较强(上图A),增殖快(B),具有较低的本底细胞死亡率(C),能摄取更多的葡萄糖(D和E)。而这群由EGFRvIII驱动的功能较为亢进的细胞群体,在面对靶向药物Erlotinib的时候,也是死得最快的(F)。不过在用Erlotinib治疗荷瘤鼠一段时间后,部分个体会出现药物抗性(G)。通过进一步研究证明,无论是在有反应(Response)还是产生抗性(Resistant)的样本,Erlotinib确实都抑制了EGFRvIII high的细胞群体比例(上图H)。那这个抗性是从何而来的呢?

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我们把GBM注射到裸鼠皮下,让它生长成一个携带EGFRvIII high和low的肿瘤。随后,将肿瘤解剖出来,通过流式分选的方法,将高、低表达的群体区分开来,再立刻分别重新注射到不同的裸鼠上。虽然前面的实验结果表明,EGFRvIII high的群体具有较亢进的恶性功能,但无论是low还是high的群体,在注射同样细胞数量的情况下,都能让裸鼠长出同等大小的肿瘤(上图A)。而这些肿瘤里面,又重新分化出具有high和low的异质群体(C)。同时令人惊讶的是,就算是一开始分离出high和low的群体,在体外培养一段时间后,high的平均表达量会逐渐降低,low的表达量会逐渐升高(B),最终这两者又会变成同样的混杂表达群体。这到底是基因表达强度的问题,还是有其他的原因?

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通过进一步实验,我们发现,原来是这些扩增的EGFRvIII位于ecDNA。通过有丝分裂时的随机分配,EGFRvIII基因的拷贝数可实现动态调节。在普通状态下,由于EGFRvIII高表达有利于肿瘤的生长,因此high的群体占据了优势。而在药物Erlotinib的攻击下,high的群体较为敏感,细胞死亡。然而在抗性群体中,绝大多数细胞都是低表达EGFRvIII的。通过FISH实验和qPCR实验(后一数据未在此展示)发现,这群Erlotinib抗性(ER)细胞,EGFRvIII基因的拷贝数特别低,并形成一种类似于均质染色区(HSR)的结构。而当药物撤除之后,EGFRvIII的ecDNA又重新出现,并且high群体又重新占据了主导。

这种动态调节ecDNA拷贝数,形成了一种类似“躲猫猫”的机制,让肿瘤逃避了药物的攻击,并在药物撤除后卷土重来。

三、尚待解决的问题:ecDNA数量动态调控的机制

那么现在问题来了,肿瘤细胞到底是通过什么方法来实现这种ecDNA数量的动态调控呢?遗憾的是,迄今为止,尚未有任何研究针对这个问题提供了明确的答案。

但这并不妨碍我们在此提出两种假说:1、被动选择机制;2、主动调节机制。

假如将每个肿瘤细胞视为独立的个体,而这些基因表达量不同的个体组成了一个异质的群体。接着,我们将药物处理视为一种环境选择压力。在第一例中,高表达DHFR基因的群体在药物MTX的压力下,具有更强的存活能力,因此得以保留与遗传(即产生子代细胞),而低表达的则被淘汰掉(死亡)。在例二中,低表达EGFRvIII的细胞则在药物Erlotinib的压力下更有存活优势。经过长期的药物选择,劣势群体逐渐消失,而优势群体被富集起来。因此最后我们能发现,肿瘤整体的DNA拷贝数发生了变化,产生了耐药性。此为被动选择机制。

而主动调节机制则是,肿瘤细胞通过某种未知的途径,“感应”环境的压力,继而产生更多或者减少携带原癌基因ecDNA的数量,从而产生抗性。

然而无论是哪一种机制,也仅有ecDNA的存在,才能让肿瘤快速改变基因拷贝数,从而获得强大的适应性。回顾《中篇》的内容,我们不难理解,假设扩增的原癌基因全部位于染色体上,要实现拷贝数的快速变化,实在太难了。

最后,本司机要声明的是:1、以上两个机制仅是假说,尚未有发表的实验数据的支持,所以不要太当真。2、这两个假说机制可以只存在一种,也可能同时存在。3、我们实验室正在进行相关研究,但在文章正式发表之前需要保密,因此具体细节无可奉告。

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/25722401?group_id=824515041477943296

(知乎栏目:老司机的生物学课堂)

文 | 吴思涵

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