N6-甲基腺苷（m6A）甲基化是最常见的RNA修饰之一，据报道其具有影响正常生命活动和疾病的重要功能。大多数研究表明，m6A修饰可以通过调节与癌症相关的生物学功能来影响癌症进展的复杂性。M6A修饰的非编码RNAs可调节非编码RNAs自身的切割、转运、稳定性和降解。它还通过影响细胞的生物学功能来调节癌症中的细胞增殖和转移、干细胞分化和内稳态。有趣的是，非编码RNAs在调节这些m6A修饰中也起着重要作用。
m6A修饰过程在哺乳动物细胞中是动态且可逆的。它具有三个至关重要的因子：writers、erasers和readers，可分别添加、去除或读取m6A位点。已经证明了METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15、ZC3H13和METTL16可以启动m6A修饰过程，这可能还需要YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3等readers的参与。相反，FTO和ALKBH5可以刺激去甲基化过程。这些调节因子已被确定为RNA代谢过程的参与者，包括选择性剪接、稳定性、翻译和miRNA加工。
Fig1. m6A修饰的功能。M6A修饰是一个动态且可逆的过程。M6A修饰是由METTL3和METTL14及其辅因子WTAP、RBM15/15B、KIAA1429和ZC3H13（writers）组成的甲基转移酶复合物催化的。m6A修饰的去除依赖于去甲基化酶FTO和ALKBH5（erasers）。M6A结合蛋白YTHDF1-3、YTHDC1-2、IGF2BP1-3和HNRNPA2B1（readers）在功能上促进了m6A修饰。
a. YTHDC1与细胞核中的RNA剪接相关。
b. YTHDC1和IGF2BP1-3与细胞核中RNA的稳定性有关。
c. YTHDC1与RNA出核有关。
d. HNRNPA2B1与细胞核中的miRNA加工有关。
e. YTHDF1、YTHDC2和YTHDF3与细胞质中的RNA翻译相关。
f. YTHDF2与细胞质中的RNA衰减相关。
通过调节细胞的生物学功能，胚胎干细胞（ESC）分化以及疾病（例如癌症）进展的各个方面也需要这些可逆过程。近年来，越来越多的研究探索了m6A修饰对mRNA代谢的调控作用，发现m6A修饰及相关调节因子在白血病、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌等肿瘤中的双重特性。Table1. 癌症中m6A关键成员的重要作用。非编码RNAs根据其长度可以分为miRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、rRNA、tRNA等。据报道，一些非编码RNAs也受到m6A修饰的调节。M6A修饰不仅影响miRNA、lncRNA和circRNA的切割、转运、稳定性和降解过程，而且还通过影响非编码RNA表达来调节生物细胞功能。此外，在某些情况下，这些非编码RNAs会影响RNA之间以及RNA与调节其特定生物学功能的蛋白质之间的相互作用。
MiRNAs是由RNA聚合酶II/III转录的初级转录本（pri-miRNA）产生的内源性编码的小RNAs（~21 nt）。MiRNAs通过微加工器和切割复合物（例如DGCR8）加工而成，该复合物在初级miRNA加工过程中起着重要作用。Fig2. m6A修饰调控miRNAs。miRNA的成熟发生在细胞核和细胞质中。
Ⅰ、在细胞核中，核内酶Drosha（一种RNase III核酸内切酶）将初级microRNA (pri-miRNA)切割为前体microRNA (pre-miRNA)。除了Drosha, DGCR8也被证明对miRNA成熟至关重要。METTL3甲基化的pri-miRNA被DGCR8识别和加工。同时，HNRNPA2B1识别m6A甲基化位点。总之，m6A修饰有助于DGCR8靶向pri-miRNA并促进pre-miRNA的形成。
Ⅱ、Dicer是另一种RNase III酶，在pre-miRNA转运到细胞质后，将pre-miRNA切割为成熟的miRNA。然后，RISC整合成熟的miRNA，并被引导至m6A甲基化调节因子mRNA上，从而通过靶标mRNA的裂解导致翻译的中断。
Alarcon等报道了METTL3甲基化的pri-miRNA被DGCR8识别和加工。并且进一步的实验显示METTL3可以促进miRNA的成熟，表明这些m6A修饰使DGCR8靶向pri-miRNA并促进miRNA的成熟。
另一项研究揭示了m6A在miRNA加工中的作用。在这项研究中，Zhang指出吸烟对胰腺导管腺癌中m6A修饰的miR-25-3p成熟的影响。研究表明，吸烟引起METTL3上调的具体调控机制涉及METTL3启动子的表观遗传调控。这种表观遗传修饰增加了pri-miR-25-3p水平的METTL3依赖性调节，并增强了miR-25-3p的加工。而miR-25-3p影响了其靶标PHLPP2的进程，从而使得AKT-p70S6K信号通路受到影响。该研究表明了METTL3-miR-25-3p-PHLPP2-AKT调控轴可能会影响吸烟诱导的胰腺导管腺癌的转化。
此外，Klinge等报道了m6A修饰对miRNAs的调节也有助于乳腺癌细胞的内分泌抵抗力。HNRNPA2/B1作为“reader”可以识别m6A甲基化。已经证明HNRNPA2/B1可促进乳腺癌细胞的增殖。HNRNPA2/B1过表达通过促进pri-miRNA发展成pre-miRNAs和成熟miRNAs的过程来促进m6A修饰的miRNA水平的增加。此外，pre-miRNAs和成熟的miRNAs可通过作用于靶标或通路来促进内分泌抵抗。最近，Fish等报道了TARBP2作为一种RNA结合蛋白，将甲基转移酶复合物募集到其目标转录本，导致转录本的m6A甲基化。而m6A甲基化导致TARBP2结合的转录本内含子保留和核RNA衰变。此外，作者发现TARBP2通过下调ABCA3和FOXN3的表达促进肺癌的生长。RISC具有核酸内切酶活性并整合成熟的miRNA。整合的miRNA可指导RISC至其靶mRNA上，从而引起靶mRNA裂解。另外，TARBP2是RISC加载复合体的重要组成部分。因此，TARBP2介导的m6A修饰可调节miRNA的过程，例如miRNA的整合、成熟和降解。但是，这一假设需要进一步的研究加以证实。lncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的转录本。lncRNAs具有m6A修饰，也可能通过某些途径调控基因表达。m6A修饰对lncRNAs的影响可能涉及多种调控机制。一方面，m6A修饰可能通过提供m6A reader蛋白的结合位点或通过调节局部RNA结构来诱导RNA结合蛋白进入，从而调节lncRNAs的功能。另一方面，m6A修饰也可能通过影响RNA-DNA三螺旋结构来调节lncRNAs与特定DNA位点之间的关系。Fig3. m6A修饰调控lncRNAs。Ⅰ、XIST通过将特定的蛋白质复合物募集到X染色体从而有效地沉默基因转录。XIST通过形成（RBM15）/RBM15B-WTAP-METTL3复合物来募集沉默复合物，从而调节基因的转录沉默。敲低METTL3或RBM15可降低m6A修饰水平，从而导致XIST介导的基因沉默受损。
Ⅱ、ALKBH5是一种m6A去甲基酶，与lncRNA FOXM1-AS相互作用以增强其功能。随后，ALKBH5促进HuR与FOXM1新生转录本的结合。最后，ALKBH5通过使FOXM1新生转录本的3’UTR去甲基化来诱导高水平的FOXM1。
在雌性哺乳动物发育过程中，lncRNA XIST通过将特定的蛋白质复合物募集到X染色体上从而发挥基因沉默转录的功能。Patil等人的研究表明，XIST可以通过形成（RBM15）/RBM15B-WTAP-METTL3复合物来调节基因的转录沉默，该复合物招募了沉默复合物。此外，敲低METTL3或RBM15可以降低特定转录本上m6A修饰的水平，从而使lncRNA X染色体失活。此外，YTHDC1识别XIST上的m6A残基，随后介导了由lncRNA诱导的基因沉默引起的调控。Zhang等人报道了胶质母细胞瘤干细胞（GSC）中，m6A去甲基化酶ALKBH5与lncRNA FOXM1-AS相互作用可促进癌细胞的增殖和致瘤性。ALKBH5可通过使FOXM1新生转录本去甲基化来诱导高水平的FOXM1转录本。在这个过程中，lncRNA FOXM1-AS与ALKBH5相互作用，可以增强FOXM1新生转录本3’UTR的去甲基化。然而，这项研究仅证明了FOXM1-AS与ALKBH5结合，至于ALKBH5是否介导了FOXM1-AS序列的去甲基化，还有待进一步探索。lncRNA MALAT1在细胞核中高度表达。MALAT1包含一系列m6A修饰，在肿瘤疾病中上调。Zhou等人的研究证实，MALAT1由于m6A修饰而发生结构变化，从而调节RNA与某些特殊结合蛋白之间的相互作用。此外，MALAT1的m6A修饰也可影响其在细胞核中的定位和活性。且MALAT1的M6A修饰可促进HNRNPG、HNRNPC或METTL16与转录本的结合，进而调节基因表达。LncRNA 1281位于细胞质中，经常发生m6A修饰。LncRNA 1281包含几个不同的m6A修饰位点，对于let-7的结合至关重要。Yang等人的研究表明改变lncRNA 1281的m6A修饰水平可以显著影响let-7水平，从而影响ESC的分化。此外，Chu等人的研究表明Olfr29-ps1依赖于m6A修饰来发挥其生物学功能。Olfr29-ps1是一种lncRNA假基因，在髓源性抑制细胞（MDSC）中表达，并受IL-6调节。GM-CSF和IL-6诱导Olfr29-ps1的m6A修饰。其中METTL3发挥着重要作用，敲低METTL3降低了MDSC中Olfr29-ps1的表达，表明m6A修饰可诱导Olfr29-ps1的形成和稳定性。随后，Olfr29-ps1的m6A修饰通过将Olfr29-ps1募集到Ago2相关的RNA复合物中来促进Olfr29-ps1和miR-214-3p之间的功能相互作用。最后，MyD88受miR-214-3p调控，敲低MyD88对MDSC免疫抑制和分化起重要作用。表明Olfr29-ps1主要依赖于m6A修饰的Olfr29-ps1/miR-214-3p/MyD88调节途径来调节MDSC的免疫抑制和分化。CircRNAs最早在RNA病毒中被发现，属于缺少3’和5’末端的非编码RNA家族，通常由pre-mRNA反向剪接产生，以环状RNAs的形式存在。作为一种参与多种生理或病理过程的环状结构非编码RNAs，circRNAs具有结构稳定性、序列保守性和组织特异性表达的特点。研究发现circRNAs，特别是外显子来源的circRNAs可以被m6A修饰。此外，甲基化circRNAs表现出蛋白编码能力。一项研究表明，组成型m6A motif在circRNAs中高度表达，单个m6A位点可以完全驱动翻译起始。研究还发现circRNAs具有m6A修饰，其受去甲基化酶FTO和METTL3/14甲基转移酶复合物的调控。进一步的研究表明，circRNAs的m6A修饰可以通过介导eIF4G2和结合蛋白YTHDF3来促进circRNAs的翻译过程。Fig4. m6A修饰调控circRNAs。m6A修饰影响circRNA的调控机制发生在细胞质中。CircRNA受去甲基化酶FTO和甲基转移酶复合物METTL3/14调控。甲基转移酶复合物METTL3/14可诱导m6A对circRNA的甲基化修饰，而去甲基化酶FTO则可以去除circRNA的m6A甲基化。YTHDF3识别m6A甲基化位点，然后将eIF4G2募集到circRNA，从而导致circRNA翻译。因此，circRNAs可以被m6A修饰，甲基化的circRNAs表现出蛋白质编码能力。在最近的一项研究中，Chen等人证明了人类内源性circRNAs的m6A修饰发挥了抑制先天免疫的重要功能。作者还发现，外源性circRNAs在体内可诱导抗原特异性T和B细胞活化、抗体产生和抗肿瘤免疫，而这些外源性circRNAs的m6A修饰可以抑制免疫激活。此外，YTHDF2通过识别m6A对于抑制先天免疫至关重要。因此，这些结果提示circRNAs也可能通过其m6A修饰来调节肿瘤的进展。但是，需要更有力的证据来证实所涉及的调控机制。综上所述，这些发现表明circRNAs与m6A成员相互作用的调控机制对癌症进展很重要，并且可能为肿瘤发生和发展提供新的见解。但是，调控circRNAs的m6A修饰的例子相对较少，还没有进行足够的研究来探索这些修饰。因此，通过对circRNA甲基化修饰的研究将进一步揭示m6A修饰在circRNA功能中的作用。m6A修饰对非编码RNAs具有调节作用，包括其产生、剪接、转运、降解和表达。有趣的是，非编码RNA水平的异常也会影响m6A水平。例如，miRNAs可以通过改变m6A修饰水平来影响干细胞分化。Chen等人的研究发现m6A位点的共有序列RRACH（R=G或A，H=A、C或U）motif与miRNAs的种子序列反向互补，表明在一定程度上，miRNA可能靶向m6A峰值区域。值得注意的是，miRNAs使用序列配对机制来调节m6A的修饰。具体而言，miRNAs通过调节METTL3甲基转移酶与具有miRNA靶向位点的mRNA的结合，从而调节m6A的丰度。然后，m6A丰度的增加会引发一系列功能，包括启动细胞重编程，从而导致多能小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。相反，减少m6A修饰的数量可以抑制细胞重编程。总之，miRNAs在m6A修饰中起重要作用，并为细胞重编程奠定了基础。Du研究报道了miR-33a可通过靶向METTL3 mRNA来影响非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖。研究发现肺癌组织中的METTL3 mRNA表达水平高于正常组织。并且MiR-33a能够直接与NSCLC细胞中METTL3 mRNA的3’UTR结合。但是，miR-33a的表达水平与METTL3呈负相关，miR-33a可同时引起mRNA和METTL3水平的下降。下调METTL3表达可抑制肿瘤细胞的生长和侵袭并促进细胞凋亡。总之，miR-33a通过靶向NSCLC细胞中的METTL3发挥肿瘤抑制作用。这一发现为miRNAs调控m6A修饰的机制提供了新见解。另外，哺乳动物肿瘤蛋白HBXIP的异常表达在乳腺癌的发生和发展中起重要作用。HBXIP在乳腺癌中高表达，并可上调METTL3表达。MiRNA let-7g作为肿瘤抑制因子可通过靶向METTL3 mRNA的3’UTR来抑制肿瘤发生。HBXIP通过抑制miRNA let-7g促进METTL3的表达，从而导致m6A修饰的增加。而METTL3表达的上调反过来促进了HBXIP的表达。这种调节机制导致在乳腺癌细胞中形成HBXIP/let-7g/METTL3/HBXIP的正反馈回路，并促进了乳腺癌细胞的发生、增殖和侵袭。此外，miR-145通过调节YTHDF2的水平来调节m6A修饰的水平和功能。越来越多的证据表明，m6A reader蛋白对于m6A修饰发挥其生物学功能是必需的。YTHDF2是第一个被发现用于调节mRNA稳定性的m6A reader蛋白。MiR-145具有多种生物学功能，已被证实与许多人类疾病有关，例如结肠癌、前列腺癌、肾癌、食道癌和卵巢癌。据报道，miR-145通过靶向其3’UTR来降低YTHDF2的表达，从而导致肝细胞癌（HCC）细胞中的m6A mRNA水平升高。然后，YTHDF2下调抑制了HCC细胞的发生、增殖、侵袭和转移（fig5）。总之，miR-145对YTHDF2的调节在肝癌细胞的生物学功能中起着重要作用。Fig5. 非编码RNAs对m6A修饰的调控。成熟的miR-145和mRNA被转运到细胞质中，从而发挥各自的作用。MiR-145通过靶向HCC细胞中YTHDF2 mRNA的3’UTR来降低YTHDF2的表达。然后，YTHDF2的减少会增加m6A mRNA的水平，从而导致HCC细胞的发生、增殖、侵袭和转移的减少。综上所述，miR-145对m6A修饰的调控在HCC细胞的生物学功能中起着重要作用。LncRNA GAS5是一个肿瘤抑制基因，可抑制癌细胞的增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化（EMT）和辐射耐受性。LncRNA GAS5-AS1是GAS5的反义RNA，其下调与TNM分期、淋巴结转移和肿瘤（如NSCLC和肝癌）的预后密切相关。Wang等人研究报道了GAS5-AS1通过作用于去甲基化酶ALKBH5和调节GAS5的m6A修饰而增强了GAS5的稳定性，从而抑制了宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移和转移。此外，m6A介导的GAS5降解依赖于YTHDF2的参与。Zhu等人研究报道了lncRNA ARHGAP5-AS1的上调促进了胃癌细胞的化学耐药性。此外，ARHGAP5-AS1通过募集METTL3来稳定细胞质中的ARHGAP5 mRNA，从而刺激ARHGAP5 mRNA的m6A修饰。最后，ARHGAP5-AS1增强了其靶基因ARHGAP5的表达并促进了胃癌细胞的化学耐药性。因此，靶向ARHGAP5-AS1/ARHGAP5轴可能是克服胃癌化学耐药性的潜在治疗策略。研究证实，circRNAs作为miRNA海绵，可以竞争性结合miRNAs，并影响其活性和其下游靶基因的表达。在某些癌症中已发现circRNAs对miRNA的调控作用。此外，miRNAs已经被证明可以调节m6A的修饰。因此，在一定程度上，circRNAs可能间接调节m6A修饰。但是，这些调节功能的机制需要进一步确认。总而言之，随着对非编码RNAs和m6A修饰的研究不断深入，非编码RNAs对m6A修饰的调节作用日益明显，并且相关的调节机制在细胞的生物学功能中发挥着重要作用。原文：Ma S, Chen C, Ji X, et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer[J]. Journal of Hematology & Oncology, 2019, 12(1): 121.
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