重大进展！5000例临床全基因组测序揭示肿瘤环状DNA全貌！再邀吴思涵独家解读自然新发现
今日，Nature Genetics《自然·遗传学》杂志刊登了有关肿瘤染色体外环状DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）研究的重大进展。论文首次在大量的肿瘤临床样本中证明了ecDNA的存在，并进一步证实了其作为一种癌基因的载体，具有活跃转录能力，以及高度开放的染色质，并且与肿瘤患者的死亡风险相关。论文作者由来自Jackson Laboratory的TCGA科学家Roel Verhaak教授团队，来自加州大学圣迭戈分校（UCSD）人类基因组计划科学家Vineet Bafna教授团队，以及来自UCSD医学院肿瘤遗传与ecDNA领域的领军实验室Paul Mischel教授团队组成。在2019年年底，该团队已在Nature《自然》杂志上刊登了有关肿瘤ecDNA结构与功能的研究。在今日上线的论文中，该团队通过生物信息学方法，对The Cancer Genome Atlas（TCGA，肿瘤基因组图谱计划）及Pan-Cancer Analysisof Whole Genomes（PCAWG，泛肿瘤全基因组分析计划）数据库中、共计5022例临床肿瘤及正常组织对照的全基因组测序数据，进行了重分析，完整描述了ecDNA的序列结构以及临床意义。（图片引自吴思涵博士2019年的Nature论文）研究发现，肿瘤中扩增的癌基因，可以从染色体上脱落下来，形成环状的DNA，即ecDNA。由于其特殊的物理结构以及细胞遗传形式，ecDNA能快速地推动肿瘤的进展，并导致肿瘤耐药。去年11月，肽度TIMEDOO邀请了ecDNA领域的专家吴思涵博士，以第一作者身份解读了刊登在Nature《自然》杂志上里程碑式的研究论文：今天，我们很荣幸再度邀请该项目的参与者吴思涵博士，第一时间为大家带来独家解读。肽度TIMEDOO：时隔一年，肿瘤环状ecDNA领域又有重大进展。相比上一次您发表在Nature上的论文，本次研究有什么新的进展？吴思涵博士：上一次的研究，我们的重心是对肿瘤ecDNA的结构与功能进行细致解读，通过超高分辨率显微成像结合多种测序技术，首次阐明了ecDNA的环状结构，并揭示了其基本分子生物学功能，同时也为后续的研究奠定了许多理论以及技术的基础。那个时候，我们的研究模型是体外培养的肿瘤细胞系。本次发表在Nature Genetics的研究，我个人是以“打辅助”的角色参与的，主要提供理论以及影像学数据的支持。首先，我们再度证明了全基因组测序和AmpliconArchitect算法，在鉴定ecDNA中的可靠性。我们将此研究方法，与数千张“金标准”的显微镜照片进行了比较，发现两者具有高度的一致性。同时我们还与专门用于捕获环状DNA的CIRCLE-seq法进行了比较，发现了几乎100%的吻合度。同时，我们进一步优化了算法，将肿瘤中的扩增片段分为Circular（环状）、Breakage-fusion-bridge（BFB，断裂-融合-桥接）、Heavily rearranged（高度重排）、以及Linear（线性）四类。经过统计后发现，ecDNA在多种瘤种中是广泛存在的。其中，有将近50%的脑胶质母细胞瘤和骨肉瘤中都含有ecDNA。而常见的肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等肿瘤中，也常见ecDNA形式的基因扩增。但在淋巴瘤、白血病，还有诸如肾癌、前列腺癌中，ecDNA较为罕见。第二，我们在数千例肿瘤临床样本中，再度证明了环状ecDNA是癌基因的载体。比如，经典的EGFR、MDM2、AKT1、CDK4等原癌基因，通常是以ecDNA的形式进行扩增的。与我们上一个研究相吻合的是，由于ecDNA的拷贝数高，而且染色质更加开放，因此，ecDNA上的基因的表达量，往往高于比其他形式的基因扩增。同时，我们还发现了，ecDNA还是基因融合的一种重要机制。尤其是在拷贝数高的情况下，在ecDNA上发生的基因融合，要比其他形式的基因扩增更加频繁。最后，我们还有一个重要的发现：携带ecDNA的肿瘤患者，其预后要比其他患者更差。我们先是统计了不同分组患者的五年生存率，发现携带ecDNA的肿瘤患者，其五年生存率是最低的。但是，直接比较五年生存率是不公平的。因为研究数据是多种不同肿瘤的混合，而有一些肿瘤，同时兼具生存期短以及高ecDNA比例的特征（比如脑胶质母细胞瘤），因此会造成数据上的偏倚。当然了，这也说明，ecDNA会倾向于在更加致命的肿瘤中出现。为了矫正这样的偏倚，我们进一步采用了多变量Cox比例风险模型的研究方法，最后发现，携带ecDNA的肿瘤患者其死亡风险是最高的。与没有基因扩增的患者相比，其死亡风险要高出48.2%。△携带ecDNA的肿瘤患者具有更高的死亡风险
吴思涵博士：首先是在大量的临床肿瘤样本中证明了ecDNA是广泛存在的。此前，我们的研究仅停留在体外培养的肿瘤细胞样本，对ecDNA在临床中的认识仍存在空白。这一次的研究正面回应了这个问题，并对每一种常见肿瘤的ecDNA阳性百分比进行了统计，明确了ecDNA在何种肿瘤中具有更高的研究价值。其次是再次支持了去年我们对ecDNA的研究成果，在大数据中证明了之前小范围研究的正确性，包括ecDNA的染色质特征以及转录特征。最后，也是最关键的，是首次在大样本中研究了ecDNA与肿瘤患者生存率的关系。我们发现，ecDNA肿瘤患者的预后更差。虽然这篇文章中的数据只是解释了相关性，但结合我们以及其他实验室的一系列论文，包括ecDNA携带并大量转录经典的原癌基因，ecDNA介导了肿瘤耐药等研究，我们不难合理地推断其中的因果关系。这也就说明了，我们急需针对ecDNA研发治疗手段。而这与深入研究ecDNA背后的各种生物学机制是分不开的。此外，我们的研究也奠定了ecDNA的相关研究手段。从实验上，二代全基因组测序结合计算机分析可以鉴定ecDNA。当然，长读长的测序技术将来也会是重要的研究手段，而且理论上会有更高的准确度，只不过在现阶段，成本还相对较高。计算分析的算法也在逐步优化。去年我们仅将肿瘤的扩增基因识别为Circular环状和Linear线性两类，在今年的研究中，我们融合了鉴定BFB和Heavily rearranged的算法。目前，该算法还处于持续开发阶段。两周前我们还讨论了如何进一步提高其准确率和特异性。不过，新版本的分析算法就需要等到下一篇论文发表时才同步公布了。肽度TIMEDOO：肿瘤ecDNA领域将往什么方向发展呢？吴思涵博士：这个问题可以从基础和临床转化两个角度来谈。1、在基础研究方面，虽然我们已经阐明了ecDNA的环状结构，并揭示了其染色质、转录、3D相互作用等分子特征，也明确了其促进肿瘤与介导耐药的功能，但是，我们对ecDNA的认识还不够充分。比如这些问题尚未有明确答案：ecDNA是怎么产生的？肿瘤细胞又是通过何种机制来维持ecDNA的存在的？在本项研究中，我们发现部分构成ecDNA的片段具有染色体灾变（chromothripsis）的特征。染色体灾变是一种高度复杂的染色体DNA重排现象，它是由染色体高度碎片化，产生数个甚至数千计的DNA碎片，并随机地重新组合在一起的过程。染色体灾变在肿瘤中是广泛存在的。此前，在我们楼上的Don Cleveland教授团队证明，染色体灾变可以在生成ecDNA。然而，经过对数千样本、数万DNA片段的统计发现，染色体灾变最多仅能解释约36% ecDNA的起源，另外大部分ecDNA的产生机制，依然不明确。总而言之，虽然肿瘤ecDNA领域近几年取得了不少突破，但我们对它的了解依然不够全面、深刻。2、在临床转化方面，从诊断到治疗，都是个大缺口。首先，我们迫切需要研发出廉价、快速的检查ecDNA的手段。尽管在基础研究中，全基因组测序法具有相当高的可靠性，多数实验室也能负担得起，但是对于肿瘤患者来说，成本显然还是太高了。粗略估计，用全基因组测序法，并考虑采样、数据分析中所涉及的人力、试剂与耗材成本，进行一次检测可能需要800-1000美金，而这还仅仅是面向科研的、营利目的不强的报价。若是商业化的临床检测，考虑到临床检测资质以及商业盈利，最终的报价会更高，这对患者来说是一笔不小的负担。当然，这个成本在未来应该会再一步降低。希望在相应的靶向ecDNA的疗法问世的同时，检测的费用也能降到多数肿瘤患者能够负担的范围内。紧接着，是如何将基础研究与临床转化相结合，造福肿瘤患者。假设我们有办法阐明ecDNA的具体生物学机制，我们或许能针对这些机制，设计专门的靶向治疗手段。特别地，有些重要的原癌基因特别难开发药物实现靶向治疗。比如大名鼎鼎的原癌基因MYC，整个领域至少花了20年的时间，仍然没有研发出具有成药价值的直接靶向手段，通常只能是间接地去影响MYC的功能或者表达。不过，在一些癌种中，MYC偏好以ecDNA的形式扩增。假如我们有办法直接靶向ecDNA，就能绕过靶向MYC的技术障碍，从而为肿瘤治疗提供新的思路。此外值得补充的是，在正常的真核细胞中，也存在着环状DNA，称为eccDNA。它的拷贝数低，体积小并因而通常不携带完整的编码基因，但可携带小RNA基因。但是，相比肿瘤大型ecDNA研究领域，eccDNA与人类健康的研究相对滞后。我相信，阐明在正常细胞中存在的小型eccDNA的功能，也是亟待探索的领域。肽度TIMEDOO：目前国内市场对ecDNA的认知是否存在偏差？吴思涵博士：这里我仅能对科研服务市场做相关的点评。而在临床转化方面，无论国内外都是在早期项目探索、孵化阶段，因而暂不做评论。在2019年年底3篇围绕肿瘤ecDNA的重磅论文发表后，我看到不少科研技术服务公司纷纷推出了相关的ecDNA检测服务。不过，这些公司在宣传上是有所偏差的。首先是混淆了在正常细胞中存在的小型环状eccDNA，以及肿瘤中存在的具有促癌性质的大型ecDNA的概念。如前述，eccDNA与人类健康、疾病之间的因果关系尚不明确（在低等生物中如酵母，倒是有明确的功能，如与衰老、抗逆性相关）。而有关肿瘤ecDNA的功能，两次访谈已经阐述了不少，简而言之就是促癌以及介导耐药。但是我看不少公司宣传文案上，并没有将两者加以区分，而是混杂在一起谈，显然会引起误会。而正因为eccDNA与ecDNA两者的性质不同，所以在检测技术以及后续的计算分析中，也是有不同的方案的。对于eccDNA来说，哥本哈根大学Birgitte Regenberg教授团队的方案是比较成熟的。目前也有来自弗吉尼亚大学Anindya Dutta教授的团队在探索用ATAC-seq的方法来鉴定eccDNA。而对于肿瘤ecDNA来说，我们团队所开发的全基因组+AmpliconArchitect方案兼具实验路线简单与成本相对低廉的优势。我们也用金标准的影像学数据进行交叉验证，证明了该技术路线的可靠性。我还看到有些公司宣传用Sanger测序的方法去验证全基因组测序的结果。这实际上是一个天大的误会。我们在去年的Nature文章附图中，确实是使用了Sanger测序的方法。但是，那只是为了回答一个不懂行的审稿人的问题。实际上，二代全基因组测序已经足够回答问题。在常规30X的测序中，ecDNA上每一个breakpoint都有数十甚至上百条reads来支持，因此再使用Sanger测序是多余的。△在经典二代全基因组测序中，ecDNA上的每一个breakpoint都有大量的测序reads来支持当然，这些认识上的偏差背后是有原因的，一是该领域相对来说探索较少，有许多尚不明确的科学问题，二是其研究范式仍在处于早期建设阶段。数月前我们已经收到了Annual Review杂志社的邀请，为ecDNA领域撰写一份年鉴综述。除了对ecDNA领域过去50年近百篇研究论文进行整理、总结外，我们还计划用一章内容，系统梳理ecDNA的研究方法。我们也希望届时收录的年鉴，能够成为引导科研人员进入ecDNA研究领域的指南。— 专访华人科学家 —
美国加州大学圣迭戈分校医学院博士后，专职从事肿瘤遗传学与基因组学研究，曾在Nature，Nature Reviews Cancer等期刊发表数十篇研究与综述论文。
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