Toll/interleukin-1 receptor(TIR)结构域是动物和植物免疫系统的经典成份，可以识别入侵病原体的分子元件【1-2】。在人类中，Toll-like受体中的TIR结构域通过蛋白-蛋白相互作用传递信号【1】；在植物中，含有TIR结构域的免疫受体通过感知胞内病原体，触发TIR结构域产生一种环状ADP-核糖变异分子（Variant of cyclic adenine diphosphate ribose, v-cADPR），最终造成细胞死亡（称为超敏反应），阻止病原体的繁殖和传播【3-4】；TIR结构域也被证明是真核细胞免疫系统Thoeris中的一个关键成份，可以保护细菌免受噬菌体感染【5】。Thoeris包含2个核心蛋白，其中的ThsB蛋白含有一个TIR结构域。最近有研究发现Thoeris的另一个核心蛋白：non-TIR蛋白ThsA具有NADase活性，暗示Thoeris防御涉及NAD+水解，可能造成感染后细胞死亡【6】。目前关于植物TIR如何介导细胞死亡及细菌Thoeris系统的抗病毒分子机制均不清楚。
2021年12月1日，来自以色列魏茨曼科学研究所的Rotem Sorek团队与Gil Amitai团队合作在Nature杂志上在线发表了题为Antiviral activity of bacterial TIR domains via immune signalling molecules的研究论文，揭示了细菌中Thoeris免疫系统介导的抗病毒信号通路，其在植物和细菌免疫中都是保守的。该研究还追踪了细菌和真核生物的TIRs之间可能的功能和进化联系。
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许多细菌防御系统在噬菌体感染时通过触发细胞死亡来保护细菌，这一过程被称为顿挫感染（abortive infection, 病毒进入宿主细胞，若细胞缺乏病毒增殖所需的酶、能量及必要的成分，则病毒不能合成自身成分；或虽合成部分或全部成分，但不能装配和释放出有感染性的病毒颗粒）【7】。作者发现Thoeris系统可以使被感染细胞在噬菌体子代成熟之前死亡（图1c），说明其主要通过abortive infection实现抗病毒功能。Thoeris系统包含两个基因：thsA和thsB，二者必须同时存在才能实现Thoeris的防御功能【5】。ThsB包含一个TIR结构域，而ThsA N端有一个sirtuin（SIR2）结构域（图1a）。近期研究表明，ThsA中的SIR2结构域具有催化NADase活性【6】。在其他噬菌体防御系统中，NAD+的缺失与abortive infection有关，同时有研究推测ThsA引起的NAD+缺失与Thoeris abortive infection有关。为了验证这一观点，作者采用LC-MS对噬菌体感染过程中的NAD+水平进行了监测。结果显示，在SPO1噬菌体感染后60分钟左右，仅在表达Thoeris的细胞中观察到NAD+的完全缺失（图1d），说明ThsA的NADase活性是导致NAD+耗竭的原因。
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图1. Thoeris引起abortive infection和NAD+耗竭
作者推测，在响应噬菌体感染时，Thoeris TIR蛋白可能会产生一种信号分子，类似于植物TIR生成的v-cADPR，这种信号分子可以触发ThsA的NADase活性，随后导致abortive infection。为了验证这个假设，作者在B.subtilis细胞中只表达Thoeris ThB TIR蛋白，并用噬菌体SPO1对这些细胞进行感染。如图2a所示，在感染中的多个时间点裂解被感染的细胞，并过滤裂解液，使其只含有小于3KDa的分子，接着将纯化后的ThsA蛋白与这些裂解液在体外进行孵育，评估这些裂解液是否影响ThsA的NADase活性。结果显示，当与表达含有TIR的ThsB蛋白的被感染细胞裂解液共同孵育时，ThsA表现出显著的NADase活性；与对照组细胞裂解液孵育时，ThsA的NADase活性并不会被触发（图2b），说明在噬菌体感染期间，Thoeris TIR蛋白产生了一种小分子具有激活ThsA的NADase活性的能力。为了进一步探究细菌TIR产生的分子对ThsA的激活是否与植物TIRs产生的分子类似，作者在E.coli细胞中过表达了植物的含TIR结构域的蛋白BdTIR（其可以持续地产生v-cADPR），并获取了其细胞裂解液。发现从表达BdTIR的E.coli中获得的裂解液也可以触发ThsA的NADase活性（图2c），说明细菌Thoeris TIR和植物BdTIR在功能上相似，二者产生的第二信使均可以激活Thoeris效应蛋白。
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图2. ThsA的NADase活性由表达TIR的感染细胞产生的小分子触发
为了进一步揭示Thoeris TIR蛋白产生的信号分子的本质，作者采用了非靶向LC-MS分析在SPO1噬菌体感染过程中表达Thoeris ThsB TIR蛋白的B.subtilis细胞的代谢产物。在感染后45min的样品中检测到了一种独特的分子，这种分子在未感染或感染后的早期时间点中检测不到，说明这种分子是TIR蛋白在响应噬菌体感染时产生的。进一步分析发现，该分子的分子质量接近于cADPR的分子质量，但其在结构上不同于经典的cADPR，是一种cADPR异构体。
ThsA除了N端的SIR2 NADase结构域外，还有一个位于C端的SLOG结构域。SLOG结构域被认为可以结合核酸来源的信号分子（例如ADPR）。TRPM家族阳离子通道中含有SOLG同源结构域，其可以被ADPR和它的衍生物触发【8】。结构分析发现ThsA SLOG结构域与TRPM2 SLOG结构域的ADPR结合口袋区域在结构上具有同源性，因此推测当TIR产生的cADPR异构体结合到ThsA C端SLOG结构域时可以激活ThsA。作者将ThsA SLOG结构域中的活性位点进行突变后（R371A），Thoeris对噬菌体的防御能力丧失。接下来，作者检测了野生型ThsA和突变体暴露在信号分子cADPR异构体中的多聚状态：在没有信号分子时，大多数的ThsA蛋白以一种单体或四聚体的形式存在；当存在信号分子时，大部分的ThsA蛋白转变了它们的多聚状态，主要以二聚体形式存在。因为暴露在信号分子下可以激活ThsA的NAD+降解活性，因此这些数据说明观察到的多聚状态的转变反应了ThsA酶的活化。进一步分析发现ThsA R371A突变体在响应信号分子时不能发生多聚状态的转变。这些数据说明ThsA的SLOG结构域驱动其多聚状态变化，以响应TIR衍生的cADPR异构体信号，从而激活SIR2结构域的NADase活性。
在自然的Thoeris系统中，thsA SIR2结构域基因通常伴有多个thsB TIR结构域基因。在同一位点的不同thsB基因之间往往存在差异，除了TIR结构域及其保守活性位点的一般结构外，通常很少有序列同一性。作者发现同一位点内不同的ThsB蛋白负责识别不同的噬菌体相关分子模式，这与真核免疫系统中TIR结构域蛋白的作用类似，说明Thoeris防御特异性取决于TIR结构域蛋白的特性。
总的来说，该研究阐释了Thoeris抗噬菌体防御系统的作用机制。如图3所示，TIR结构域蛋白ThsB负责识别噬菌体感染，一旦感染被检测到，TIR结构域就会变得具有酶活性，并催化cADPR异构体分子的产生；这一分子反过来作为一种信号分子，通过与ThsA C端SLOG结构域相结合，改变ThsA的多聚体状态激活ThsA的NADase活性，然后NADase效应从细胞中耗尽NAD+，产生无法支持噬菌体复制的细胞条件并导致细胞死亡。该文章证实了TIR来源的cADPR异构体可以作为免疫第二信使，同时对将来植物模型系统的研究提供指导信息，以揭示这种TIR产生的分子在植物对病原体的免疫反应中的作用。该研究使得我们可以真正在机制上理解免疫系统，将有助于我们从容地面对新出现的病原体。
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图3. Thoeris系统的作用机制模型

参考文献

1. Fitzgerald, K. A. & Kagan, J. C. Toll-like receptors and the control of immunity. Cell 180, 1044–1066 (2020).
2. Burch-Smith, T. M. & Dinesh-Kumar, S. P. The functions of plant TIR domains. Sci. STKE 2007, pe46 (2007).
3. Wan, L. et al. TIR domains of plant immune receptors are NAD+-cleaving enzymes that promote cell death. Science 365, 799–803 (2019).
4. Balint-Kurti, P. The plant hypersensitive response: concepts, control and consequences. Mol. Plant Pathol. 20, 1163–1178 (2019).
5. Doron, S. et al. Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome. Science 359, eaar4120 (2018).
6. Ka, D., Oh, H., Park, E., Kim, J.-H. & Bae, E. Structural and functional evidence of bacterial antiphage protection by Thoeris defense system via NAD+ degradation. Nat. Commun. 11, 2816 (2020).
7. Lopatina, A., Tal, N. & Sorek, R. Abortive infection: bacterial suicide as an antiviral immune strategy. Annu. Rev. Virol. 7, 371–384 (2020).
8. Huang, Y., Roth, B., Lü, W. & Du, J. Ligand recognition and gating mechanism through three ligand-binding sites of human TRPM2 channel. eLife 8, e50175 (2019).
来源： 北京生物结构前沿研究中心