浙大校友揭示DNA损伤又一机制，自学Python实现追踪DNA复制“许可”动态，为抗肿瘤药物研发提供新思路
“新冠疫情造成了研究迟缓。不过在那段时间，我有大量的 Bench-free Time，自学了 Python 语言，后来已经可以独立写代码分析数据，这反而加速了后来的研究，也算是弥补了因疫情导致的延缓。”虽然是药理学博士，但浙大校友梅柳竟然自己学会了计算机编程语言 Python。
Python 也助力她发表了一篇顶刊论文，完成发论文这件大事之后，33 岁的梅柳即将迎来另一件大事——成为一名妈妈。
图 | 梅柳（来源：梅柳）
在半个月前发表的论文中，利用首创的分析 MCM 加载动态的方法，她和团队首次将活细胞成像技术与固定细胞免疫荧光成像技术，联合用于检测单细胞水平 MCM 复合体在人类亚细胞核内的加载动态，填补了该复合体在不同染色质环境的加载动态研究的空白。其中，MCM 的全称是 Minichromosome Maintenance Protein Complex，指的是微染色体维持蛋白复合体。
1 月 26 日，相关论文以《在不同染色质环境中起源许可动态差异的后果》（The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments）为题，发表在 Nucleic Acids Research（IF 16.971）上[1]。目前，梅柳在北卡罗莱纳大学教堂山分校生物化学与生物物理系做博后研究，是此次论文的第一作者。
图 | 相关论文（来源：Nucleic Acids Research）
细胞周期第一阶段的晚期，对异染色质 MCM 加载极为重要
一般来讲，细胞在每次分裂之前都要完成 DNA 复制，以确保分裂之后每个后代细胞仍然含有与母细胞数量相同的 DNA，只有这样才能保证遗传稳定性。
但在 DNA 复制之前，细胞得先给部分 DNA 发放复制“起源许可”，这样一来 DNA 只能在获得许可的位置开启复制。DNA 复制许可（DNA Replication Licensing）假说认为，染色质 DNA 在细胞分裂发生之前精确复制、且仅复制一次的过程中，“起源许可”的作用至关重要。
细胞内所有 DNA 都必须被复制，无论是处于致密的异染色质环境，还是处于疏松的常染色质环境。这意味着在有限的 DNA 复制准备时间内，也就是在 G1 期之内（G1 phase，一个细胞周期的第一阶段），所有 DNA 都要获得合适的起源许可。
已有研究发现，起源许可数量不足、或分布不均，都会导致染色体遗传的不稳定。对于“起源许可”的生化过程、即 MCM 复合体的 DNA 加载来说，此前已有大量详实报道。
（来源：Nucleic Acids Research）
但是，关于这一过程本身对于染色质环境是否具有偏好性、或优先级的研究，目前尚未报道。
而在该研究中，梅柳通过向人视网膜色素上皮细胞导入带有不同荧光的细胞周期追踪蛋白，并使用活细胞成像记录细胞的生长周期。
在活细胞成像结束后，梅柳又通过特殊试剂去除游离的 MCM 并固定细胞，随后进行 MCM 以及染色质标签的免疫荧光染色实验，并通过高分辨率共聚焦显微镜、对单个不同时期的 G1 期细胞进行多层次 3D 成像。
这时根据活细胞成像记录，即可知晓每个细胞的分裂史、以及所处时期；而根据固定细胞免疫荧光成像，则可获得 MCM 复合体的亚细胞核加载的数量。
综合两者得到的信息，即可绘制出 MCM 在不同 DNA 复制准备时期、以及不同染色质区域的加载量，从而得到 MCM 的加载动态。
基于以上方法，梅柳发现在 G1 早期异染色质加载 MCM 复合体的速率低于常染色质，然而在 G1 晚期异染色质与常染色加载 MCM 速率相当。
（来源：Nucleic Acids Research）
基于此现象她推测，相比常染色质来说，G1 晚期对于异染色质加载足量 MCM 更重要。为验证这一假设，梅柳通过诱导表达细胞周期蛋白 cyclin E 从而缩短 G1 期长度，迫使细胞过早进入 DNA 复制期也就是 S 期（S phase，即 DNA 合成期）。
在这些具有极短 G1 期的细胞中，其 G1 晚期异染色质 MCM 加载不足的现象显著高于常染色质。在随后的 G2 期，这些具有极短 G1 期的细胞核内异染色质的 DNA 损伤程度，明显高于正常细胞。而在两组细胞中，常染色质的 DNA 损伤则无明显差异。
进一步研究发现，导致常染色质和异染色质 MCM 加载动态的差异，部分源于 ORCA 蛋白在常染色质和异染色质在 G1 不同时期的分布差异，进而导致了所招募的 ORC 的分布差异。
梅柳表示：“我们的研究首次发现：相较于常染色质，异染色质许可在 G1 期相对延后，这意味 G1 晚期对于异染色质 MCM 加载极为重要。而这一特殊的许可动态，决定了在 G1 期异常缩短的细胞中比如原癌基因激活或抑癌基因丢失的细胞，异染色质极易因为遭受许可不足，而导致基因组不稳定性增加。因此，完整的 G1 期对于维持基因组的稳定性极其重要。”
（来源：Nucleic Acids Research）
回顾研究步骤，她表示首先是提出立题依据，其所在实验室对于“起源许可”的研究经验比较丰富，此前该实验室的博士生雅各布·马特森（Jacob Matson）发现，干细胞的“起源许可”速度明显快于已分化细胞。
相比分化细胞，干细胞的染色质环境通常更为疏松。这些背景促使梅柳和团队提出如下研究假设：疏松的常染色质和致密的易染色质，是否也在“起源许可”过程中存在差异？如果存在差异，那么对细胞有怎样的意义？其中的分子机制又是如何？
有了假设，就要建立实验方法，这一过程非常耗时。因为细胞中的 MCM 大部分游离于细胞中，只有一部分 MCM 会加载到 DNA 上，且加载过程是单向不可逆的，而目前并没有任何可用的实时 MCM 加载追踪标记物。
为了研究 MCM 加载动态，梅柳不得不先依靠活细胞成像技术，去获取大量单个细胞的“分子年龄”，并通过免疫荧光染色及共聚焦 3D 成像，进一步测量单个细胞 MCM 加载情况，以根据这些信息绘制出 MCM 在不同亚细胞核内的加载动态。
同时，大量单细胞成像的数据分析也十分复杂，梅柳的合作伙伴通过各种调试，开发出一系列 Python 源代码，这时终于实现了在不同染色质环境内，对批量单细胞 MCM 的定量分析。
（来源：Nucleic Acids Research）
接下来，便是实验实施和结论得出的阶段。
期间，梅柳对比了 MCM 在常染色质和异染色质的加载动态，发现 MCM 在异染色质的加载过程相对延后，但是最终进入 DNA 复制期时，单位含量 DNA 的 MCM 加载数量相当。
进一步研究后，她发现如果人为缩短 G1 期，会导致异染色质的 DNA 损伤，不过并不会对常染色质产生影响。这说明，对于维持基因组的稳定性来说，合适长度的 G1 期的极其重要。此外，梅柳还发现了 MCM 在常染色质和异染色质加载差异的分子机制。
（来源：Nucleic Acids Research）
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概括来说，此次研究揭示了缩短 G1 期可导致 DNA 的损伤的其中一个原因。如果开发出可以明显缩短 G1 期的药物、并用于 G1 期较长的肿瘤细胞，就能损伤肿瘤细胞的 DNA，从而促进肿瘤细胞的凋亡。
“也就是说，我们为将来抗肿瘤药物的研发提供了一种新的角度和理论依据。”梅柳表示。
同时，她也坦言研究遇到了许多挑战，尤其首创的追踪 MCM 加载动态的方法。期间尝试了许多方法，才优化出最好的方法。
其中一个挑战是活细胞成像在普通荧光显微镜下完成，而固定染色后的细胞最终成像要在另一台共聚焦显微镜下完成。
她遇到的难题之一是如何在共聚焦显微镜下找到活细胞成像时记录的细胞，为此梅柳最开始应用了底部带有网格标记的培养皿，每次都能根据网格位置找到目的细胞群，但是这种培养皿价格昂贵且只能做一组实验。
经过与该校显微镜中心专业人士的多次讨论，最终决定使用普通活细胞成像的培养板，但是需要人为在板底标记一个特殊位置，并设置该位点的坐标轴为（0，0），这意味着其他成像位点相对于该标记也有了自己的相对坐标。如此一来，无论将培养板转移到任何显微镜下，都可根据这些坐标找到初始成像位点。
对于后续计划，她表示该研究的实验手段仍有改进空间。接下来可能会在检测手段上进一步优化，或采用完全不同的手段，比如利用 DNA 成像技术以便更精确地揭示不同染色质环境下的 MCM 加载动态。
（来源：Nucleic Acids Research）
“我是有回国打算的”
梅柳是黑龙江海林人，本科毕业于黑龙江八一农垦大学制药工程专业；硕士毕业于哈尔滨医科大学药理学专业，师从杨宝峰院士，期间她主要研究心血管疾病；博士毕业于浙江大学基础医学院药理学专业，师从吴希美教授，博士期间以第一作者发表高质量 SCI 论文两篇（Cancer Letters, 2016; Oncogene, 2021）。
其表示：“我在博士期间的主要工作，在于首次鉴定了 Hippo 信号通路的关键激酶 LATS1 的 SUMO 化修饰，对于 LATS1 激酶活性的调控至关重要，并且发现这一修饰决定了 LATS1 的生物学功能的多样性。”
在博士期间，梅柳曾多次获得“优秀研究生”称号并获得国家奖学金一次。目前，她在美国北卡罗莱纳大学教堂山分校生物化学与生物物理系从事博士后研究，导师为简·库克（Jean Cook）教授，研究方向为细胞周期调控机制。
目前国内对科研越来越重视，科研环境也越来越越好。对于博后出站后的安排，她说：“我是有回国打算的，打算一边找工作一边把手上目前在研的课题做完。”
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参考：
1、Mei, L., Kedziora, K. M., Song, E. A., Purvis, J. E., & Cook, J. G. (2022). The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments.Nucleic Acids Res.
来源：麻省理工科技评论
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