手把手教你miRNA研究套路及引物设计方法

前面我们讲述了miRNA的生成过程，以及常用预测靶基因数据库。对于miRNA的研究，相对来说比较简单，可以称得上“投资小，回报快”。通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA 并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前 miRNA 研究的重要方向。

下面我们就简单讲一下miRNA的研究方法，可以分为以下几个方面：

①miRNA芯片:利用miRNA 芯片，可以高通量分析不同肿瘤样本或者不同组织中miRNA的差异表达，对靶基因进行分析，及发育变化中的作用。

②过表达和封闭:通常基因功能研究常常采用过表达、干扰、敲除等方法。研究miRNA的功能也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics（mirRNA的成熟体），或者构建mirRNA过表达载体，实现过表达特定mirRNA的目的。通过构建抑制miRNA的inhibitor，实现抑制特定mirRNA功能的目的。观察靶基因mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA 功能研究的常用方法。

③双萤光素酶报告系统:通过生物信息学分析获得miRNA的靶基因及相应的结合位点是功能研究的关键内容。将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的双萤光素酶报告载体中，通过检测荧光素酶报告系统发光的强弱，对miRNA以及靶基因结合位点进行体外功能验证。

④QPCR 验证：可以用来检测miRNA 以及其靶mRNA 和相关mRNA 等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA 设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

对于miRNA芯片或者miRNA mimics/inhibitor等，一般可以选择从公司购买。对于QPCR 验证，涉及到的主要是miRNA的引物设计，而miRNA的引物设计方法与常规引物设计方法不同。下面就详细讲解一下miRNA的荧光定量PCR引物设计方法-茎环法。

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miRbase：microRNA是基因注释数据库。通过miRbase，我们可以得到microRNA的成熟序列。

1. 打开主页，输入查询名称以mir-191-5p为例

2. 在显示结果中，选择第一个mmu-miR-191-5p.

3. 点击进入之后，可以看到mmu-miR-191-5p的成熟序列信息

4.点击sequence,得到mmu-miR-191-5p序列，长度为23个碱基。

>mmu-miR-191-5p MIMAT0000221

CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG

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在设计microRNA引物时需要借助一款小软件，miRNA RT primer.

1.一般可以采用的的茎环序列是：

5′ GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3′

2.pcr通用下游引物是: 5′ CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3′

3.在软件中输入mmu-miR-191-5p的成熟序列，点击确定

4.如图所示，首先可以得到miRNA的逆转录引物 5′—GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAGCTGC—3′

以及miRNA的模板序列

5′—CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTGGTCGTATCCAGTGCAATTGCCGACTCCACGACACGCACTGGATACGAC—3’。

5.下一步设计PCR上游引物。,选择primer3plus 在线引物设计网站，将模板序列的第一条序列、mmu-miR-191-5p浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示

6. 点击General setting,设置引物扩增长度,引物长度，点击pick primers

7. 引物设计结果如下所示

总结一下，设计得到mmu-miR-191-5p的：

pcr上有引物是5’CAACGGAATCCCAAAAGC3′

pcr通用下游引物是: 5′ CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3′

来源：医学方