近日，瑞士苏黎世大学的科学家们通过一项名为REVeRT（mRNA跨剪接双AAV载体技术）的新技术，成功展示了他们能够重新组装并表达大型基因。这一技术基于mRNA跨剪接，可实现多功能的分割位点选择，以及在各种体外模型、人体器官样本以及体内环境中高效地重组不同分割的基因，包括用于基因组和表观基因组编辑的主编辑器和CRISPR激活剂。REVeRT还可以通过单一或多重剂量给予，以靶向多种小鼠组织和器官中的基因。REVeRT的灵活性和高效性使其成为临床和基础研究应用的极具前景的工具。
这项研究成果已经发表在《自然通讯》（Nature Communications）杂志上，题为“mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy” 。
双AAV载体用于大型基因重组 大型基因，如CRISPR-Cas模块中的基因激活剂（CRISPRa），需要双AAV载体以实现高效的体内传递和表达。当前双AAV载体方法的主要缺点是重组效率较低，也称为“DNA跨剪接”。
为了克服这一限制，已经开发了几种方法，它们都使用相同的基本思想：兴趣基因被分成两部分，并分别打包到不同的AAV载体中，称为双AAV。在两个AAV载体同时传递到目标组织后，分割的基因部分可以在AAV基因组、mRNA或蛋白质水平重新组装。
在AAV基因组水平的基因重组的各种版本依赖于AAV基因组同源重组或串联化。然而，在AAV基因组水平上的DNA跨剪接通常导致重组效率较低。使用分割内源子（自剪接氨基酸序列）的方法在蛋白质水平上进行工作，通常具有非常高的重组效率。然而，分割内源子方法不够灵活，产生相等数量的免疫原或致病内源子，引发了翻译方法的严重安全担忧。
鲜有关于通过双mRNA跨剪接的AAV重组的研究。在DNA跨剪接中，mRNA剪接在同一RNA分子上发生，并在成功重组基因组之后清除了分割片段之间的非编码部分。虽然一些在mRNA跨剪接中使用的序列元素与DNA跨剪接中使用的元素相同，如互补区域和剪接位点，但重组发生在两个不同的mRNA分子之间。
直到现在，mRNA跨剪接和AAV只在细胞培养实验中用于表达CFTR基因一次。尽管如此，它尚未经过充分的安全性或有效性测试，并且尚未在活体生物、疾病模型或基因编辑方法中有效使用。
使用mRNA跨剪接实现大型基因重组 来自Elvir Becirovic实验室的Lisa Maria Riemayer博士和她的同事们开发了REVeRT，这是一种灵活且高效的双AAV载体技术，基于mRNA跨剪接。他们展示了REVeRT可以用于恢复CRISPR激活剂（CRISPRa）和主编辑器的功能，以及在各种组织中添加大于单个AAV载体所能携带的疾病相关基因。例如，Cas9-VPR29，这是最强大的CRISPRa模块之一，太大以至于无法容纳在单个AAV载体中。REVeRT可以在多种治疗相关的组织和器官中（包括视网膜、心脏、肺、肝脏、骨骼肌和大脑）功能性地重组完整的Cas9-VPR。
使用双REVeRT AAV载体，Reidmayr博士和她的同事们还展示了一种体内多重激活和抑制基因的方法。结合具有不同间隔长度的sgRNA来同时靶向不同的基因座位，允许同时敲除和激活（CONNACT）多个基因。CONNACT可以治疗需要有效抑制有缺陷等位基因并插入额外基因来弥补失去功能的情况，如某些遗传病。
此外，CONNACT策略还可以作为治疗涉及多个基因或通路的其他疾病的平台，如癌症或神经退行性疾病。使用REVeRT和CONNACT可以同时激活抑制肿瘤的基因并关闭致癌基因，或关闭促凋亡或对细胞有害的基因并同时打开神经保护基因。
苏黎世大学的研究人员还在小鼠中进行了初步实验，通过眼内注射使用双REVeRT载体技术，以治疗导致失明的遗传病，通常是由大型ABCA4基因的突变引起的。他们获得了初步的实验数据，这些数据暗示在Stargardt小鼠模型中改善了视网膜退行和功能。然而，需要更大的动物队列和额外的功能测量来充分评估REVeRT技术在Stargardt基因疗法中的治疗效果。
由于REVeRT在给予腹腔内注射后仍然在许多组织或器官中表现出良好的效果，这可能使治疗某种疾病更加容易，特别是如果局部给药途径不起作用或需要同时转导多个器官。尽管REVeRT在效力方面取得了高度有希望的结果，但需要在非人灵长类动物中进一步调查其耐受性、毒性或免疫反应等安全参数，然后才能用于临床试验。
参考文献：“mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy,”
编辑：王洪
排版：李丽
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