新发现：两种抗CRISPR蛋白可调控基因组编辑活动

在基因编辑领域，一种被称为Cas3的I型CRISPR蛋白就像“吃豆人”一样，能够连续咀嚼核苷酸链，实现从几百个碱基对到200 kb的有针对性大片段缺失。然而，由于缺乏分子相当于四个彩色鬼魂的调控机制，Cas3的广泛而单向的基因组编辑活性基本上是不受调控的。

密歇根大学医学院生物化学系助理教授Yan Zhang博士及其与康奈尔大学的合作者发现了两种能够“关闭”Cas3的抗CRISPR蛋白，为更安全、更可控的CRISPR应用铺平了道路。

这项研究成果发表在《分子细胞》杂志上，题为《利用I-C型CRISPR-Cas3中的激活和失活机制进行基因编辑应用》。

生物技术应用中的抗CRISPR蛋白 某些噬菌体进化出小的抑制蛋白，被称为抗CRISPR，以使细菌失活CRISPR效应器进行免疫防御。

研究人员已经利用抗CRISPR（Acrs）蛋白来失活Cas9，一种II型CRISPR系统，以改变基因编辑活动的时机、位置或组织特异性扩散，或减少不需要的离靶事件的数量。

抗Cas9核酸酶的Acrs提供了在许多应用背景下控制基因编辑的可编码刹车。例如，在Cas9 RNP传递后延迟引入AcrIIA4可以减少人类细胞中的离靶编辑。组织特异性的Acr表达控制了在小鼠的靶器官中安全进行体内Cas9编辑。Acrs还被用作基因驱动器的安全控制，生物传感器和合成基因电路的促进因子，噬菌体疗法的促进因子，并用于捕获配体以定量测定体外Cas9的存在。

尽管CRISPR-Cas9可以通过使用两个称为单导RNA（sgRNA）的靶向RNA诱导大基因组缺失，这两个sgRNA包围要删除的区域，但Cas9与两个sgRNA可能增加不希望的离靶突变的机会，以及在切割位点之间发生意外的逆突变。

调控Cas3介导的基因组缺失 CRISPR-Cas3是一种I型CRISPR系统，依赖于一个称为CRISPR相关复合物（Cascade）的多亚基核糖核蛋白复合物（RNP）来促进DNA目标搜索，并在与目标DNA形成复合物时激活。尽管I型CRISPR启用的真核应用不断增加，但尚未开发出Acr关闭开关来控制这些技术。

通过比较和分析几个Cascade-Cas3复合物的冷冻电子显微镜“快照”，张研究组以高分辨率揭示了结合和切割机制。在这一结构证据的基础上，他们确定了两种高效的抗CRISPR蛋白，AcrIC8和AcrIC9，通过两种略有不同的机制阻止Cascade与DNA靶标结合。重要的是，在人类基因编辑实验中，这两种Acr都显示出抑制Cascade-Cas3诱导的DNA缺失和Cascade与P65转录激活子结构域融合介导的基因激活。

AcrIC8和AcrIC9代表了第一套作为多亚基CRISPR基因编辑器关闭开关的Acrs，为更安全、更可控的I型CRISPR应用铺平了道路。这为通过时间、空间、组织特异性以及光或药物控制的Acr调控改善I型基因编辑结果奠定了基础。AcrIC8和AcrIC9的剂量依赖性反应可能允许可调控的控制，而不仅仅是一个简单的开关。

尽管Acr蛋白作为Cas效应器的关闭开关具有巨大的前景，但张博士及其同事表示，不太可能找到对广泛的CRISPR-Cas系统高度有效的Acrs，因为Cas同源体之间的结构变异可能削弱Acr的高亲和力相互作用。狭谱Acr可能允许对一个CRISPR变体的控制，而不干扰其他变体，而广谱Acr可以保护整个生物体免受所有编辑剂的潜在活性。因此，了解每个Acr对不同CRISPR系统的交叉反应至关重要。

参考文献：http://dx.doi.org/10.1038/s41598-023-50138-9

编辑：周敏

排版：李丽