重磅丨外泌体miRNA会是Ⅰ型糖尿病患者的福音吗？

外泌体能够在细胞间转运蛋白质、mRNA和非编码RNA等分子，在细胞间通讯中起着重要作用，是近年来生物医学领域的研究热点。这次，小编要为您分享一篇发表于《Cell Metabolism》的研究，探索外泌体miRNA在Ⅰ型糖尿病发生发展中的作用。一起来看看高分文章的研究策略与方法吧！

研究背景

Ⅰ型糖尿病是一种自身免疫性疾病，具有独特的分子病理特征，例如免疫细胞浸润胰岛，以及选择性地清除胰岛β细胞。患有Ⅰ型糖尿病的患者必须终身使用胰岛素，给生活造成极大不便。因此，为了寻找新型治疗策略、预防疾病发展，了解胰岛β细胞与浸润性免疫细胞之间的相互作用至关重要。来自美国的研究人员发现，T淋巴细胞能够通过释放含有miR-142-3p、miR-142-5p和miR-155的外泌体作用于胰岛β细胞，促进β细胞凋亡。这可能是Ⅰ型糖尿病产生发展机制的一部分。

首先来了解一下外泌体miRNA的研究策略

下面小编就来逐步分析，看看研究人员是如何基于上述策略，得出激动人心的研究成果的？

1.目的基因筛选

先前，研究者已使用基因芯片分析了4周龄与8周龄的NOD小鼠（Ⅰ型糖尿病动物模型）胰岛细胞的miRNA全表达谱，发现与对照组相比，miR-142-3p/-5p、miR-150与miR-155的表达量显著失调。这些miRNA能够调节免疫细胞活动，但在胰岛细胞中的表达量通常很低。本研究中，研究人员使用流式细胞仪分选出糖尿病前期NOD小鼠的胰岛β细胞后进行检测，发现β细胞中，miR-142-3p/-5p与miR-155的表达显著上调（下图）。

图1 糖尿病前期NOD小鼠的胰岛β细胞中，miR-142-3p/-5p与miR-155的表达显著上调

免疫细胞对β细胞的部分有害作用是通过释放促炎症细胞因子实现的，因此，研究者同时尝试将小鼠胰岛细胞暴露在促炎症细胞因子中，但并未观察到miRNA的水平变化，说明上述miRNA水平的增加并非由促炎症细胞因子引起。

2.外泌体分离与RNA鉴定

鉴于免疫细胞释放大量的外泌体，研究者猜测胰岛细胞内miR-142-3p/-5p与miR-155的水平出现增长是由外泌体引起。为了验证该假设，研究者使用超速离心富集来自人类Jurkat细胞（一种人T淋巴细胞系）的外泌体（exoT）与来自NOD小鼠T淋巴细胞的外泌体（exoNOD），并利用电镜观察、粒径分析与特征蛋白分析等方式鉴定其外泌体特征（下图）。

图2 exoT与exoNOD的特征鉴定（A&B：电镜照片；C：外泌体特异性蛋白鉴定；D&E：外泌体粒径分析）

接下来，研究者使用qPCR验证上述外泌体中的miRNA含量，发现这些T淋巴细胞释放的外泌体中均存在miR-142-3p/-5p、miR-155。为了验证这些miRNA确实能够转运至胰岛β细胞，研究者将小鼠胰岛细胞与exoNOD共同孵育72小时，随后用qPCR检测胰岛细胞内的miRNA水平，发现miR-142-3p/-5p与miR-155水平均出现显著上调（下图左）。为了进一步验证增加的miRNA是否来源于外泌体，研究人员借助于人类miR-155与啮齿动物的miR-155之间一个碱基的差异，将来自人类T淋巴细胞系的外泌体exoT与大鼠的胰岛细胞共同孵育，随后使用物种特异性qPCR引物进行扩增，发现大鼠胰岛细胞内增加的miR-155完全来源于人类T细胞外泌体，而非内源性合成的mmu-miR-155（下图中、右）。

图3 胰岛细胞内上调的miRNA来源于外泌体

为了验证miR-155是否以活性形式转运入β细胞，研究者构建了荧光素酶报告系统。将转染了针对miR-155的荧光素酶报告系统的鼠胰岛细胞系MIN6B1与exoT共同孵育48或72小时后，观察到荧光素酶活性降低（下图），证明miR-155是以活性形式转运入细胞。

图4 荧光素酶报告系统显示miR-155以活性形式转运入细胞

3.miRNA功能研究

细胞凋亡试验

将大鼠胰岛细胞与exoT共同孵育，胰岛细胞产生了显著的细胞凋亡，这种凋亡可以被pan-caspase抑制剂zVAD抑制（下图上）。将人胰岛细胞与人血清中T细胞释放的外泌体（exo-hT）共同孵育，同样观察到miR-142-3p/-5p、miR-155水平上升，细胞凋亡现象增加（下图下）。

图5 外泌体引发胰岛细胞凋亡

接下来，研究者使用miRNA mimic分别直接增加大鼠胰岛细胞内的miR-142-3p/-5p与miR-155水平，发现胰岛细胞均出现凋亡（下图上）。随后，研究者使用anti-miR尝试阻止被转运的miRNA发挥作用。anti-miR不影响外泌体转运miRNA，但在miRNA进入胰岛细胞后，anti-miR能够捕获miRNA，阻止其发挥作用。与预期相符，胰岛细胞转染入anti-miR后，对exoT引起的细胞凋亡产生了抵抗效应（下图下）。

图6 miRNA效应蛋白筛选

4.miRNA作用机理研究

（1）靶基因筛选

为了探索T细胞外泌体引发β细胞凋亡的机制，研究者对经exoNOD处理的小鼠胰岛细胞进行了RNA表达谱与信号通路分析。结果显示，与细胞因子（cytokine）和细胞趋化因子（chemokine）信号通路相关的蛋白水平出现上调，包括Ccl2，Ccl7和Cxcl10（下图）。研究同时尝试了在小鼠胰岛细胞中直接过表达miR-142-3p/-5p与miR-155，以及将人类胰岛细胞与人类T细胞外泌体exo-hT共同孵育，均同样观察到Ccl2，Ccl7和Cxcl10水平上调。

图7 miRNA效应蛋白筛选

（2）信号通路鉴定

人们已经知道，激活NF-κB信号通路可导致Ccl2，Ccl7和Cxcl10等蛋白的表达水平产生变化，同时，NF-κB能够启动胰岛β细胞凋亡。为了验证T淋巴细胞外泌体是否激活了胰岛细胞的NF-κB信号通路，研究者将鼠胰岛细胞系MIN6B1与exoT共同孵育，观察到NF-κB向细胞核转移（下图左），说明该因子被激活。向细胞中转入miR-142-3p/-5p与miR-155 mimics后，观察到同样的转定位效应（下图右）。值得一提的是，实验中转定位的NF-κB相对于未转移蛋白的比例，与细胞暴露在促炎症细胞因子后产生的效应极为相似（下图中）。

图8 NF-κB的转定位效应

5.动物实验验证

上述研究提示，在Ⅰ型糖尿病早期，免疫细胞浸润胰岛β细胞时，一组从免疫细胞转运至β细胞的miRNA可能对疾病发展具有影响。为了在动物体内验证上述假设，研究者基于腺病毒载体构建了一个包含胰岛素启动子、GFP与miR-142-3p/-5p、miR-150、miR-155结合位点的“miRNA海绵”（下图左）。将该载体腹腔注射入8周龄的NOD小鼠体内后，观察到载体依照预期特异性表达于胰岛β细胞内。至32周龄时，未注射载体的对照组NOD小鼠中，80%患上了糖尿病，而接受了“miRNA海绵”注射的NOD小鼠中仅有40%患病（下图右）。

图9 左：“miRNA海绵”结构示意右：实验组与对照组生存曲线

组织学分析显示，相比患病小鼠，未患病的小鼠体内胰岛素含量更高，并且具有更低的胰岛炎症评分。另外，与体外实验结果一致，未患病小鼠胰岛细胞中的Cxcl10表达量较低（下图左）。Cxcl10表达量降低甚至从小鼠8周龄时已开始出现（下图右）。

图10 未患病小鼠胰岛细胞中的Cxcl10表达量较低（Sp-Np：患病小鼠；Sp-prot：未患病小鼠；红色荧光：Cxcl10；绿色荧光：胰岛素）

未患病小鼠胰岛细胞中的Cxcl10表达量较低（Sp-Np：患病小鼠；Sp-prot：未患病小鼠；红色荧光：Cxcl10；绿色荧光：胰岛素）

参考文献：Guay C, Kruit JK, et al. Lymphocyte-Derived Exosomal MicroRNAs Promote Pancreatic β Cell Death and May Contribute to Type 1 Diabetes Development[J]. Cell Metab, 2018 Oct 5. doi: 10.1016/j.cmet.2018.09.011.

来源：锐博生物

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