荧光肌营养不良小鼠点燃潜在的反义寡核苷酸药物

马萨诸塞州综合医院（MGH）的研究人员开发了一种最常见肌营养不良症——强直性肌营养不良I型（DM1）的荧光小鼠模型，这可能有助于科学家找到治疗这种遗传性疾病的新方法。该研究团队使用基因工程小鼠进行的初步研究已经表明，反义寡核苷酸(ASO)的修饰形式能够靶向并纠正DM1导致的异常RNA剪接。在这种小鼠中，骨骼肌蛋白可根据是否成功治疗而发出不同颜色的荧光。

“这种新型荧光模型可以简单地通过使用摄像机拍摄活体小鼠的照片来监测治疗药物活性，”该研究负责人MGH神经科和哈佛医学院神经病学助理教授Thurman Wheeler博士表示。相关研究成果于2018年12月7日以题为“Non-invasive monitoring of alternative splicing outcome to identify candidate therapies for myotonic dystrophy type 1”发表在Nature Communications上。

肌营养不良是一组导致进行性肌肉无力和消瘦的遗传性疾病，作者解释道。肌强直性营养不良（DM）是成人中最常见的肌营养不良疾病，7500人中就有1人受到影响。该疾病是由DM蛋白激酶（DMPK）基因中的CTG重复扩增（CTGexp）引起的，但是目前还没有可以改变疾病进程的治疗方法。DM具有两种亚型，其中DM1影响RNA剪接。DM1相关突变影响骨骼肌中多种蛋白质的剪接，以及参与胰岛素代谢和心脏功能的蛋白质。研究人员表示，突变型DMPK-CUGexp mRNA在肌肉中的表达会导致肌强直（肌纤维收缩延迟松弛）、组织病理性肌病和进行性肌肉消瘦。

目前急需针对肌营养不良症的新疗法和更好的实验工具来帮助寻找新疗法，但存在的一个关键障碍是缺乏适当的动物模型来评估新的候选药物。“目前测量药物活性的方法涉及肌肉组织的生化分析，这种方法既昂贵又耗时，并且可能需要大量动物才能达到必要的统计功效，”该研究团队评论道。

Wheeler博士研究团队现在利用了一种用于细胞研究的基于荧光蛋白质的系统，将其应用于活体动物身上，点亮骨骼肌组织蛋白质。在DM1双转基因小鼠模型中，受异常RNA剪接影响的骨骼肌组织纤维发出荧光绿色，而那些纠正剪接的骨骼肌组织纤维则发出红色荧光。“通过将已确定的强直性肌营养不良I型小鼠模型（取决于靶RNA序列的剪接）与在肌肉中表达红色或绿色荧光蛋白的小鼠模型进行杂交，我们开发了一种模型，在接受治疗前肌肉呈绿色，治疗成功后则转变呈红色，“Wheeler博士指出。

TR;HSALR bi-transgenic mice as a therapy reporter model for DM1

通过检测候选药物治疗后动物肌肉中红色和绿色荧光之间的比率，表明该药物在纠正异常剪接方面的有效性。该研究团队还开发了一种基于激光激发的荧光光谱系统，用于可视化荧光信号。

该研究团队首先使用一种靶向异常剪接事件的现有反义寡核苷酸（ASO）来测试他们的模型。ASOs是一类经修饰过的，能与RNA结合的核酸分子。“在DM1转基因小鼠中，通过ASOs靶向RNA介导的疾病过程可以逆转RNA错误剪接，消除肌强直，减缓肌病进展……”作者解释道。在将ASO注入肌肉后，红/绿比率在三天内开始增加，并持续数周。49天后的肌肉组织分析证实，治疗已纠正了异常的RNA剪接。第二组测试通过皮下注射不同的ASO用于纠正原始DM1小鼠模型中的RNA剪接，也产生了治疗效果，红/绿比率在第一次注射后14天内增加，并随着后续剂量继续增加。

Imaging therapeutic antisense oligonucleotide drug activity in vivo

ASOs并不是治疗DM1的理想选择，作者指出。尽管它们对骨骼肌有效，但“药物活性不如在其他组织中（如肝脏）强，这可能是由于组织生物利用度差和药效不足所致。”另一种方法是使用配体共轭反义(LICA)技术，将轭合物添加到ASOs中以增加药物摄取。该研究团队在小鼠模型中测试了LICA修饰的ASO，以确定它是否可以在骨骼肌中起作用，并确定使用非共轭ASO进行过度治疗是否有任何益处。

In vivo comparison of LICA and the unconjugated parent ASO

LICA ASO开始显示治疗活性的速度是非共轭ASO的两倍，并且在一半剂量下有效，“这表明它的效力至少是非共轭ASO的两倍，”研究人员表示。“我们的数据支持进一步开发LICA技术，用于治疗DM1和其他靶向骨骼肌的ASO应用，”他们总结道。“该模型可用于快速鉴定候选疗法，以降低DM1中CUGexp转录本的致病性，包括新的ASO化学和轭合物、小分子、短干扰RNA（siRNA）、用于产生反义RNAs的基因治疗载体、挽救异常剪接的基于蛋白质的疗法、以及减少基因组CTG重复长度或抑制CUGexp重复序列转录的基因编辑方法。“

LICA oligonucleotide treatment effects

“我们的研究结果支持LICA技术进一步开发用于治疗DM1。除了新的ASOs，其他治疗策略，如小分子候选药物、siRNAs和基于蛋白质的疗法也可以使用该模型进行测试，“Wheeler博士说。“从长远来看，它将成为测试基因编辑治疗方法的理想选择，因为它们已经具有很好的使用价值。快速发现有希望的治疗方法和尽早抛弃失败的候选方法将有助于使患者更快地获得有效的治疗，并且开发成本更低。“

文章来源于：https://www.genengnews.com/news/fluorescent-muscular-dystrophy-mouse-lights-up-potential-antisense-oligo-drugs/

参考文献：

Hu N, Antoury L, Baran T M, et al. Non-invasive monitoring of alternative splicing outcomes to identify candidate therapies for myotonic dystrophy type 1[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 5227.

来源：锐博生物

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