2018年初，赛诺菲以39亿欧元收下纳米抗体龙头药企Ablynx，每股收购价格比竞争对手诺华诺德整整高出47.5%。此笔高额并购引来了产业界对于纳米抗体的关注，不少公司跃跃欲试，希望通过纳米抗体在激烈的抗体药物竞争中占得一席地位。1993年，比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家Hamers-Casterman团队第一次报道骆驼中出现的一种不同于免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的特殊抗体（图1）。这是一种缺失轻链的抗体，被称为重链抗体(Heavy-chain-onlyantibodies，HcAbs)。重链抗体包含两个恒定区 (CH2和CH3)，一个铰链区和一个重链可变区 (Variable heavy chain domain，VHH)。VHH 抗体又被称为纳米抗体(Nanobody，NB)，它保留了重链抗体完整的抗原结合能力（图2）。纳米抗体由4 个保守序列和3 个互补决定区组成(Complementarity-determining region， CDR) ，纳米抗体的CDR3 含有 16~18 个氨基酸残基，比人和鼠的 VH （分别有 12 和 9 个氨基酸残基）更长，并且可以形成凸环结构，使得纳米抗体更容易与抗原结合，且由于体积小，能够结合到一些比较难结合的表位（图3)1。纳米抗体的分子量只有15 kDa，是普通抗体的十分之一，因此适用于多种给药途径，适应人群更广泛。并且，纳米抗体具有良好的组织穿透能力，可以快速、均匀地扩散至全身，因此为实体瘤以及需要通过血脑屏障给药的疾病，提供了新的治疗方法2。纳米抗体基因序列与人VH基因家族3 序列（VH3）具有高度同源性3，又缺乏容易刺激免疫反应的Fc段，所以在人体内的免疫原性相对较低4。纳米抗体 VHH由于其 FR2 中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性比普通单抗要高，且聚合性减少，因此在做多价抗体上更有优势。纳米抗体具有独特的理化性质，可以在极端条件下，如高压或酸性下依然维持活性，并有可逆的去折叠能力5,6。另外，纳米抗体结构简单，由单一基因编码，可以在细菌或者酵母菌中大量生产，生产成本低廉。因此在生产、运输、保存等方面更具备产业化的优势。图3. 单抗的VH区域和纳米抗体的VHH的区域对比纳米抗体容易改造、形成多价形态，是抗体界的“百变星君”
纳米抗体由于分子量小，是单一基因编码，容易进行基因工程改造，并且可以通过短小的连接序列聚合多个纳米抗体，形成多价或者是多特异的抗体结构 (图4)。双价或者多价的抗体能识别同一种表位，但是比单价的抗原亲和力更高。双特异性或多特异性抗体，可以结合不同靶点，或者是同样靶点上的不同结合区域，比单价抗体具有更强的抗原识别能力。纳米抗体容易和其他结构(如BSA、IgG-Fc 等)形成新的融合分子。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能，因此可以与其他药物联用，或者是应用于诊断和充当多种领域的实验研究工具。作为抗体界的“百变星君”，纳米抗体的应用场景广阔。纳米抗体的龙头公司，Ablynx的产品线中充分利用了纳米抗体易改造的特点，布局了多种抗体结构，包括双特异抗体、三特异抗体、多价抗体（2价到4价）、人源化纳米抗体、同个靶点的不同抗原表位抗体，也有结合放射性元素作为诊断类的产品（图5）。利用纳米抗体的易改造的优势，可以针对不同的适应症，设计结构不同的抗体，从而达到最优化的药效及最低的副作用。纳米抗体筛选分为羊驼免疫、淋巴细胞提取、纳米抗体文库构建、噬菌体库构建、特异性噬菌体筛选、大肠杆菌表达、抗体纯化等步骤（图6）。要筛选高亲和力、特异性的纳米抗体，建立优质的纳米抗体库是关键的一步。常用的库包括免疫库、天然库以及（半）合成库，每种库都有其优劣势。其中免疫库是最常用的，可以筛选出自然免疫系统下产生的特异性的抗体，天然库和合成库用的相对少，但是可以补充免疫库的库容。库容的大小、VHH的多样性、抗体种系等是评估库的质量的重要标准。一般来说，要达到亲和力为nmol级别的成药性抗体，文库大小应该要在10的9次方以上。Ablynx的卡普赛珠单抗（Caplacizumab）是第一个上市的纳米抗体，用于治疗获得性或免疫介导的血栓性血小板减少性紫癜（TTP），并被加入到标准疗法中。此产品标志着纳米抗体在激烈的传统抗体竞争中占有了一席地位，其他产品处于preclinical到临床III期之间（图7）。国内进展最快的公司是苏州康宁杰瑞。通过与东南大学合作，康宁杰瑞建立了免疫来源的骆驼纳米抗体噬菌体展示筛选平台，并利用该平台开发了重组人源化 PD-L1 单域抗体KN035。KN035于2016年4 月申报临床并获得受理，是全球首个进入临床开发的PD-L1单域抗体，已在美国、中国和日本的多个临床试验超过500名患者中开展研究。国内研究纳米抗体的公司包括三种类型，一类是做纳米抗体药，代表企业包括苏州康宁杰瑞，亿腾医药。另外一类是用纳米抗体做CAR-T细胞疗法，包括南京传奇、深圳普瑞金、博生吉等。第三类是CDMO公司，也是数量最多的，包括成都阿帕克、康体生命科技等（图8）。此种公司布局，一是说明国内研发纳米抗体的公司越来越多，对于相关的CRO服务的需求也开始增多。另外一方面，纳米抗体应用于CAR-T也被一些公司所看好，希望能在细胞治疗方面也能通过纳米抗体形成差异化竞争。纳米抗体应用于细胞治疗具备几方面优势，包括生产成本低，且多靶点不容易聚合和互相影响等，因此可以利用纳米抗体研发出低成本，多靶点的CAR-T产品。另外由于纳米抗体组织穿透力强，且容易改造，因此也被寄望解决CAR-T治疗实体瘤的难题。要在竞争中占有一席地位，纳米抗体公司必须形成差异化竞争
比利时生物制药公司Ablynx是纳米抗体的先驱者也是龙头企业。Ablynx创立于2001,于 2017年上市, 2018年被赛诺菲39亿欧元收购。Ablynx拥有第一个上市的纳米抗体产品卡普赛珠单抗（Caplacizumab）。此产品的成功在于几个方面：首先，市场切入点好。在Caplacizumab上市之前，aTTP没有特异性疗法，治疗方式只能采用血浆置换或者免疫抑制来缓解，并且仍有高达10-20%的死亡率，同时还有治疗后易发生治疗耐受，停止血浆置换后病情迅速进展等问题。因此，治疗上有极大未被满足需求。其二，这个适应症能充分利用纳米抗体区别于普通抗体的优势，能够扬长避短。首先Caplacizumab是首个针对aTTP的特异性疗法，可以直接结合到vWF的A1区域，阻止血小板性微血栓的形成。纳米抗体在血液里能快速均匀分布，药效稳定，因此对于血液类疾病有天生的优势。另外，虽然纳米抗体有半衰期短的问题，但是此款药物的机理就是结合vWF，而通过这种结合又能直接延长其半衰期，保证其在血中保留的时间，同时又解决了纳米抗体的不足（图9）。除了对适应症的切入点好外，Ablynx还拥有技术优势：拥有可以灵活构建双价、三价等多特异性纳米抗体的技术平台（详情见上），且专利保护强。Ablynx的产品线非常丰富，不仅仅局限于肿瘤，也涉及血液、炎症、呼吸系统疾病等众多疾病。在商业模式上也有多种开发方式，包括自己开发、直接给大的药企做合作开发，或者直接授权开发等。Ablynx与AbbVie、BoehringerIngelheim、Eddingpharm、Merck& Co、Merck KGaA、Novartis、Novo Nordisk、Sanofi 和 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.等都有合作，既将研发失败的风险进行成本控制，也保证了其平台开发的药物在后续有大药厂的充沛的资源支持（图10）。康宁杰瑞的第一款产品虽然是已知靶点，且市场竞争激烈，但是产品与目前已经上市和在研的PD-(L)1抗体相比，也有明显的差异化优势：KN035是第一款可皮下注射的PD-(L)1抗体药物，适用于不适合输液患者，并且常温下稳定，能有效降低医疗成本。此外，康宁吉瑞的其他产品线还包括应用于血液类、眼科以及感染类疾病等的抗体（图11）。这些领域也都能发挥纳米抗体的分子量小，容易改造，在体内能迅速分布等优势，与单抗形成对比。综上所述，要打造一个成功的纳米抗体产品必须要充分利用纳米抗体区别与传统抗体不同的优势，如可灵活改造、组织穿透性好、水溶性高、可低成本量产等，做到扬长避短，才能在激烈的市场竞争中抢占一席。要做到以上，需要对于药物市场、纳米抗体本身拥有非常深刻的认识与积累。
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吴越等 《纳米抗体在癌症治疗中的应用》，生物工程学报，July25, 2017, 33(7): 1085−1090
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van Bockstaele F, Holz JB,Revets H. The development of nanobodies for therapeutic applications. Curr OpinInvestig Drugs, 2009, 10(11): 1212–1224
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Muyldermans S. Nanobodies:natural single-domain antibodies. Ann Rev Biochem, 2013, 82: 775–797
-
Sheridan C. NatureBiotechnology, 2017, 35(12):1115-1117
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Pérez JMJ, Renisio JG, PrompersJJ, et al. Thermal unfolding of a llama antibody fragment: a two-statereversible process. Biochemistry, 2001, 40(1): 74–83
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Dumoulin M, Conrath K,VanMeirhaeghe A, et al. Single-domain antibody fragments with highconformational stability. Protein Sci, 2002, 11(3): 500–515
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Feng D. et al. 2018. MolecularImmunology, 96: 37-47
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