前面给大家分享了一篇应用GEO/TCGA数据库挖掘CRC早期诊断和良好预后的循环外泌体miRNA生物标志物的文章《GEO/TCGA数据挖掘：外泌体miRNA轻松发4.5分Biomarker Paper》。今天给大家分享一篇利用外泌体miRNA测序技术评估肿瘤来源外泌体miRNA作为早期非小细胞肺癌的潜在诊断生物标志物的文章。该研究在Discovery阶段通过外泌体miRNA高通量测序确定候选靶标，随后在Validation set和Symptomatic set通过qRT-PCR和ROC分析评估了候选外泌体miRNA或外泌体miRNA panel作为biomarker的诊断效用。
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图1. Biomarker发现策略示意图

  研究背景  

肺癌仍然是中美两国男性和女性癌症死亡的主要原因。晚期诊断是改善肺癌预后的主要障碍。miRNAs在肺癌的诊断和预后中得到了广泛的研究。但利用外周血确定早期NSCLC诊断中腺癌和SCC特异性miRNA表达谱的研究却很少。另外，体液外泌体miRNAs的鉴定证明了其在NSCLC的临床诊断和预后方面的潜在应用价值。然而，血浆中肿瘤细胞来源的外泌体miRNAs能否提示早期NSCLC诊断尚不清楚。本研究的目的是鉴定肿瘤来源的外泌体生物标志物，能够作为一种无创方法在早期诊断中区分腺癌和SCC，从而在早期阶段提高NSCLC诊断的特异性和敏感性。

  研究策略  

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图2. 外泌体miRNA生物标志物研究思路

  研究结果  

1. 外泌体抽提与鉴定
提取健康对照、AC和SCC患者总的和肿瘤来源外泌体，并通过Western blot和红外成像系统对外泌体进行鉴定和分析。
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图3. 外泌体的鉴定
2. 鉴定健康志愿者与腺癌和SCC患者肿瘤来源外泌体中与血浆总外泌体相关的miRNAs (Testing set)
研究人员采用miRNA-seq鉴定了能够区分健康组与腺癌组和SCC组的miRNAs。并通过进一步的分析，选取了腺癌患者中20个上调和31个下调的miRNAs，SCC患者中15个上调和20个下调的miRNAs，进行下一阶段实验。
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图4. 通过miRNA-seq数据的统计分析鉴定腺癌（AC）和SCC特异性miRNAs
3. 定量PCR验证miRNA-seq数据
基于qPCR的方法对总外泌体和肿瘤来源外泌体（TME）进行评估，鉴定了27个最显著的腺癌和SCC特异性miRNAs。发现与健康组相比，腺癌患者中有11个miRNAs显著高表达，13个miRNAs表达水平较低；SCC患者中有6个miRNAs显著高表达，8个miRNAs表达水平较低。随后，选取四个先前已报道为NSCLC生物标志物并在腺癌和SCC肿瘤来源的外泌体样品中表达的miRNAs（let-7b-5p、let-7e-5p、miR-24-3p和miR-486-5p）进行验证。qPCR实验数据验证了miRNA-seq表达谱的可靠性。并且发现miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p是腺癌特异性，miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b是SCC特异性。
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图5. qPCR检测所选取miRNAs的表达水平
4. 循环血浆和肿瘤来源外泌体之间差异miRNA表达（Validation set）
研究发现miRNA在超离心后沉积物和外泌体缺失的血浆上清液之间存在明显的表达差异。与外泌体缺失的血浆相比，let-7b-5p和miR-486-5p（可区分NSCLC患者和健康个体）在外泌体中的表达丰富。腺癌特异性miR-181b-5p和SCC特异性miR-320b也富集在外泌体中。另外，发现let-7b-5p、miR-23a-3p和let-7e-5p在组织和循环外泌体之间密切相关。
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图6. 肿瘤来源外泌体miRNA和循环血浆miRNA相关性
5. 外泌体miRNA panels作为诊断生物标志物的诊断准确性，用于检测早期腺癌和SCC患者（Symptomatic set）
为了评估miRNA-seq谱数据对NSCLC的早期诊断价值，选择let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p，并使用qPCR测量了60个受试者标准化的Ct值，鉴定出43个NSCLC患者。通过测量miR-181b-5p和miR-361b-5p以及miR-10b-5p和miR-320b的组合Ct值，进一步鉴定出43名NSCLC患者中分别有31名腺癌患者和11名SCC患者。
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图7. AC和SCC特异性肿瘤来源外泌体miRNA的早期诊断准确性评估策略
此外，用于NSCLC诊断的4个miRNAs在区分NSCLC患者和非NSCLC患者中的AUC值为0.899，灵敏度为80.25％，特异性为92.31％。用于腺癌诊断的两个miRNAs（miR-181-5p和miR-361-5p）在区分腺癌患者和NSCLC患者的AUC值为0.936，灵敏度为80.65％，特异性为91.67％。用于SCC诊断的两个miRNAs（miR-320b和miR-10b-5p）在区分SCC患者和NSCLC患者的AUC值为0.911，灵敏度为83.33％，特异性为90.32％。3个miRNA panels可作为NSCLC的主要诊断生物标志物。通过将腺癌或SCC特异性miRNAs纳入诊断，可以通过进一步的病理诊断来改善预后。
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图8. 外泌体miRNA诊断价值
参考文献：Jin X, Chen Y, Chen H, et al. Evaluation of Tumor-Derived Exosomal miRNA as Potential Diagnostic Biomarkers for Early-Stage Non–Small Cell Lung Cancer Using Next-Generation Sequencing[J]. Clinical Cancer Research, 2017, 23(17): 5311-5319.来源：锐博生物