MicroRNA研究迫切需要制定高度标准化的流程方案-肽度TIMEDOO
密歇根大学Muneesh Tewari博士最近的研究发现，RNA测序文库制备方法可能对microRNA定量不一致。该研究评估了9个实验室提供的结果，描述了可以减少流程和序列特异性偏差的文库制备方法，从而提高测序准确性和相似性。
在microRNA（miRNA）分析中，研究人员会遇到一个好的和不利的情况。好的方面是：miRNA图谱在生物标志物发现中显示出了巨大的前景。不利的情况是：不同研究团队生成的miRNA图谱并不总是重叠的。

问题在于miRNA分子由很短的核苷酸序列组成，它们对探针设计和标记选择提出了挑战。不同miRNA在退火反应中的解链温度可能存在很大的差异，它们的浓度可能是按数量级变化的，并且它们很难与miRNA前体和转录后修饰产生的变体区分开。因此，鉴定和定量miRNA分子本质上具有挑战性。

问题的另一个方面是，miRNA存在于不同的组织、分离的细胞和细胞外囊泡中，并且在生物流体中游离时会与蛋白质结合。不同的miRNA样本类型需要不同类型的提取技术，即使是同种类型的提取技术也可能存在微小但最终意义重大的变化，导致不同的结果。其他变化的来源还包括miRNA测量和数据解释。

为了克服这些可变性，从而找到更多需要的共同点，研究人员正在努力标准化miRNA的分析流程方案，协调来自不同研究团队的研究结果，并开发能够提供可靠诊断和预后结果的应用程序。随着此项工作的推进，逐步实现了miRNA作为生物标志物的潜力，这些标志物已在最近的许多研究中得到证实。

MicroRNA作为生物标志物

许多研究表明miRNA图谱可能因健康状况不同而有所差异。这一点很容易得到证实。只需要打开搜索引擎并输入几个关键术语：miRNA、生物标记物、综述和癌症-或者其他疾病，如心血管疾病或神经退行性疾病。

除了回顾，还可以查阅目前关于miRNA生物标志物研究的最新报道。例如，在过去一年中，发表了针对以下情况的新发现：

  • 支气管肺发育不良，可导致低出生体重婴儿死亡或长期疾病（阿拉巴马大学伯明翰分校，JCI Insight）。
  • 心房颤动是一种心律失常，常因缺乏症状而被忽视（东京医科大学，Circulation）。
  • 卢伽雷氏病（Lou Gehrig病），或肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），一种破坏神经细胞并导致永久性残疾的神经退行性疾病（以色列特拉维夫大学，The Journal of Neuroscience）。
  • 与睡眠剥夺有关的认知表现缺陷。（宾夕法尼亚大学医学院，SLEEP 2018）。
  • 阿尔茨海默病（印第安纳大学，Nature Scientific Reports）。
  • 脓毒症是一种极端且危及生命的感染反应，可引发全身炎症（哥伦比亚大学欧文医学中心，Nature）。
  • 血液兴奋剂，输注自体红细胞以增强运动表现（杜克大学，British Journal of Haematology）。

MicroRNA分析要略

MicroRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过与mRNA结合、抑制其翻译或导致其降解来调控基因表达。尽管目前发现的miRNA并不是特别多（只有大约1000个被认为是来自人类基因组），但每个miRNA可能调节数百个mRNAs。因此，miRNA参与许多生物学过程，包括细胞分化、增殖和凋亡。

当miRNA表达出错时，可能引起包括基因表达的失调，这反过来会导致疾病的发生。幸运的是，miRNA在各种样本类型中（液体活检样本以及新鲜和固定的组织样本）相对稳定，这提高了miRNA能够被充分定量以便识别疾病特征的可能性。

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MicroRNA定量和分析要略可以从许多来源进行研究，包括美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心Muneesh Tewari博士研究团队发表在Nature Reviews Genetics中的一篇权威文章。概述了不同样本类型的miRNA分析工作流程，强调了质量控制的重要性，并总结了主要的miRNA定量技术。工作流程包括：
  • 纯化技术（例如凝胶电泳、免疫沉淀和激光捕获显微切割）。
  • 质量控制检查（例如测量spike-in寡核苷酸浓度或管家RNA表达、分光光度分析、或自动毛细管电泳）。
  • MicroRNA测量技术（例如基于qRT-PCR的方法、基于杂交的方法和RNA测序）。
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RNA分析工作流程

专家评论——关于目前miRNA研究现状及发展方向
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1、哪种类型的工具和试剂对miRNA研究至关重要？
Dr. Horejsh：有效、安全且可重复的miRNA纯化工具在此过程中至关重要。显然，如果存在特定miRNA的纯化偏差或miRNA与蛋白质复合物的分离效率低下，则很难进行生物标志物的发现。

Dr. Angeloni：对于miRNA的原位杂交检测，正确的样品制备和具有良好信噪比和特异性的探针是至关重要的。对于PCR和测序技术，第一个限制因素是从不同样品中分离出足够量的高质量RNA。对于其中一些分子技术，下一个关键因素是要有有效的扩增接头或良好的茎环引物，以便准确地将miRNA转化为可用于分析的cDNA。

2、目前用于miRNA研究的工具和试剂有哪些局限性?
Dr. Horejsh：目前用于外泌体纯化的标准方法是超速离心。这种方法可靠，但也很繁琐且耗时。它也不适合高通量。无需超速离心即可沉淀外泌体的试剂将使外泌体纯化更加快速且自动化。然而，基于外泌体纯化方法的miRNA表达似乎存在差异。此外，目前市场上大多数miRNA纯化工作流程都是完全手动的。将这种类型的工作流程应用到大型生物标志物发现或研究项目是非常困难的。

Dr. Angeloni：由于越来越多的miRNA标志物与不同疾病相关并在诊断中变得重要，因此从小样本中检测出更多miRNA标志物的需求正在增加。对于一些基于PCR的技术来说，很难区分可能因单个核苷酸而不同的miRNAs。此外，从各种体液(尿液、血清和其他体液)中分离出的高质量RNA的数量可能过低，无法准确鉴定低浓度的miRNA。当重要的miRNA标志物因单个核苷酸而异时，这些因素可能对某些诊断应用造成严重限制。

3、miRNA研究工具和试剂如何改进？
Dr. Angeloni：由于miRNA表达模式的多样性可能与一些癌症和非癌症疾病相关，在有限大小的样本中检测不同miRNA表达模式的技术变得越来越重要。此外，与其他疾病一样，个体间标志物表达模式可能有所不同，为了研究和诊断的目的，分析不同个体间表达模式的差异需要使用新的分析技术和生物信息学分析工具。在这两个领域，多路复用分析平台和新的数据分析工具正在为这些挑战提供解决方案。
4、microRNA最近被用于液体活检的诊断。那么miRNA还有其他令人兴奋的新应用吗?
Dr. Horejsh：我相信我们对miRNA生物学的认识还处于早期阶段。正如我们已经看到循环游离DNA [cfDNA]在肿瘤学研究中的兴趣和用途不断增加一样，miRNA的重要性也将继续增加。我期待更好地理解外泌体、蛋白质、循环cfDNA和miRNA如何在疾病早期更广泛地用于癌症研究，从而朝着缓解或治愈的方向平衡发展。

Dr. Angeloni：随着miRNA表达的变化或序列变异导致不同疾病的发展，这为新的治疗靶点打开了大门。因此，miRNAs作为治疗药物的使用已经得到了一些成功的测试。另一个令人兴奋的方法是miRNA靶向药物的开发。一些公司正在开发针对心血管疾病、一些传染病、代谢性疾病、癌症和一些其他非癌症疾病的miRNA药物。由于miRNA涉及广泛的人类疾病，开发新的有效miRNA靶向治疗策略具有广阔的前景。

循环MicroRNAs作为生物标志物

miRNA分析技术的一个挑战性且具有潜在价值的应用是鉴定循环生物标志物。这种生物标志物可以在通过非侵入性手段获得的患者样品中寻找到，允许重复取样以及疾病和治疗监测。 然而，正如Tewari博士在综述中指出的那样，“在考虑潜在的循环miRNA标志物时，对分析前和分析变量进行严格控制的必要性越来越受到关注。”

这种关注早在2012年的评论中就提到过，现在依然适用。为了解决这一问题，Tewari博士最近致力于促进液体活检研究的可重复性，通过RNA测序来定量miRNA。

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MicroRNA来源于pre-miRNA，其自身折叠形成一个包含小区域双链RNA的茎环结构。通过Dicer将环去除，留下两个互补的RNA分子：随从链和引导链（整合到RNA诱导的沉默复合物中）。引导链或miRNA可能附着在互补的mRNA上，在这种情况下，RISC的Argonaut蛋白会降解mRNA。miRNA还可以与互补的mRNA结合，抑制翻译。因为它不需要依赖完美的互补性，一个miRNA可以沉默数百个基因。
“不同的人正在使用不同的方法对小RNA进行测序，有时会得到不同的结果，”Tewari博士说。“如果继续这样下去，那么这个领域将很难取得进展。”

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正如《Nature Biotechnology》中所描述的那样，Tewari博士研究团队制备了相同的样本，并将它们送往全国各地的九个实验室进行分析。每个实验室都使用多种测试方案对四个不同的样本进行测序，包括1个血浆样本和3个合成RNA样本。这些实验室总共测试了9种不同的测序方案，包括4种商用试剂盒和5种实验室开发的方案。
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研究设计概述

“方案和序列特异性偏差都被鉴定出来，包括降低小RNA-seq精确测量miRNA中腺嘌呤-肌苷编辑能力的偏差，”该文章的作者写道。“我们发现通过文库制备方法可以减轻这些偏差，这些方法包含了具有简并碱基的适配器。”

“我们意识到，”主要研究作者Maria D. Giraldez博士说。“不仅不同的方法会产生不同的结果，而且在给定的方案中，任何微小的变化都会带来重要的变异程度。为了比较实验室之间的结果，关键是使用一种通用的、高度标准化的流程方案。”

根据该研究，不同的测序方法对单个标志物的丰度估计不同，而且往往不准确。该研究还表明，使用联合实验室开发的方法可以改善这些估算。最后，正如密歇根大学的新闻稿所指出的，当使用RNA测序来比较不同样本之间单个miRNA的相对量时，所有方法都能得到准确且可重复的估计值。

来源：锐博生物

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